BD, 555212, Conjunto ELISA de TNF humano BD OptEIA™

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869042
Descripción: Descripción El set OptEIA™ para factor de necrosis tumoral humano (TNF, anteriormente conocido como TNF-α) contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para TNF humano natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización de ensayos Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales de laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: El estándar de este conjunto está calibrado frente a TNF humano recombinante expresado en baculovirus purificado, producido en BD Biosciences Pharmingen. En este conjunto se evaluó el Estándar Internacional NIBSC/OMS 87/650 (TNF humano recombinante expresado en E. coli). El factor de conversión para el material NIBSC es el siguiente: 1 μg de TNF-α NIBSC 87/650 = 1,14 μg de TNF BD OptEIA™.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5 con NaOH 10 N. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone (n.° de cat. SH30088, inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. 4. Solución de sustrato: Tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el set de reactivos de sustrato TMB BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555214). 5. Solución de parada: 1 M H3PO4 o 2 N H2SO4 Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta, un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco lavador o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción automática de datos 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado mediante centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y permita que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: recolecte el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Agite suavemente con vórtex para mezclar. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, inmediatamente** alícuota la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 μl por vial y congela a -80 °C hasta por 6 meses. **Si es necesario, almacena a 2-8 °C hasta por 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. (No dejes el estándar reconstituido a temperatura ambiente). 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepara un estándar de 500 pg/mL a partir de la solución madre del estándar. Mezcla en vórtex. (Consulta las instrucciones de dilución en el Certificado de Instrucciones/Análisis). b. Agrega 300 μL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiqueta como 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL, 15,6 pg/mL y 7,8 pg/mL. c. Realice diluciones seriadas añadiendo 300 μL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Preparación del detector de trabajo (Nota: incubación en un solo paso de los reactivos de biotina/estreptavidina). Añada el volumen necesario de anticuerpo de detección al diluyente de ensayo. Dentro de los 15 minutos anteriores al uso, añada la cantidad necesaria de reactivo enzimático, agite con vórtex o mezcle bien. Para las diluciones recomendadas, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Para una placa de 96 pocillos completa, prepare 12 mL de detector de trabajo. Deseche cualquier detector de trabajo restante después de su uso. Procedimiento detallado del ensayo 1. Cubra los micropocillos con 100 μL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire los pocillos y lave 3 veces con ≥ 300 μL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 μL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare diluciones estándar y de muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 μL de cada estándar, muestra y control en los pocillos apropiados. Selle la placa e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 5 lavados en total. 8. Agregue 100 μL de detector de trabajo (anticuerpo de detección + reactivo SAv-HRP) a cada pocillo. Sella la placa e incuba durante 1 hora a TA. 9. Aspira/lava como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este paso de lavado final, remoja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto para cada lavado. 10. Agrega 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 11. Agrega 50 μL de solución de parada a cada pocillo. 12. Lee la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 minutos de detener la reacción. Si la corrección de longitud de onda está disponible, resta la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Agrega 100 μL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incuba durante la noche a 4 °C. 2. Aspira y lava 3 veces. 3. Bloquea las placas: 200 μL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incubar 1 h a temperatura ambiente. 4. Aspirar y lavar 3 veces. 5. Añadir 100 μL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 h a temperatura ambiente. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Añadir 100 μL de detector de trabajo (Ab de detección + SAv-HRP) a cada pocillo. Incubar 1 h a temperatura ambiente. 8. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min). 9. Añadir 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. 10. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm en 30 min con corrección λ de 570 nm. Cálculo de los resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Dibuje la curva estándar en papel milimetrado, con la concentración de TNF en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibuje la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de TNF de las muestras desconocidas, encuentre el valor medio de la absorbancia de la muestra desconocida en el eje y y dibuje una línea horizontal hasta la curva estándar. En el punto de intersección, dibuje una línea vertical hasta el eje x y lea la concentración de TNF. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de TNF por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos por computadora, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se analizaron en el ensayo BD OptEIA™ a ≥ 100 ng/mL (excepto donde se indique) y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 4 pg/mL). Humano recombinante: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, eotaxina, G-CSF (10 ng/mL), GM-CSF, GKO, IFN-γ, CD23, linfotactina (10 ng/mL), MIP-1β, MCP-1, MCP-2, MCP-3, 4, NAP2, IP-10, NT-3, PDGF-AA, SCF (10 ng/mL), LT-α (TNF-β), VEGF Ratón recombinante: IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-15, IFN-γ, GM-CSF, MCP-1, TCA3, TNF Rata recombinante: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF, RANTES (10 ng/mL) Otros: IL-10 viral (10 ng/mL), TNF de conejo (10 ng/mL) Limitaciones del procedimiento · Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. · No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. · Los sets BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del set. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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