BD, 558535, equipo ELISA de TNF de rata BD OptEIA™

Reactividad: Rata (Prueba de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869216
Descripción: Descripción El set OptEIA™ para factor de necrosis tumoral (TNF) de rata contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para TNF de rata natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización del ensayo Los sets BD OptEIA permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: este inmunoensayo se calibra frente a TNF de rata recombinante expresado en baculovirus purificado durante el desarrollo del producto.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento - Carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; añadir 7,13 g de NaHCO3, 3,56 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo - PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₃, 2,0 g de KH₂PO₃, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado - PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato - Tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato TMB de BD Pharmingen™ (n.º de cat. 555214). 5. Solución de parada -1 M H3PO4 o 2 N H2SO4 Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta, un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado por centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y deje que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: Recoja el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra el vial con cuidado para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Anote la cantidad de proteína indicada en el vial del estándar liofilizado y registre la concentración del estándar reconstituido a continuación para uso futuro. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Agite suavemente en vórtex para mezclar. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, alícuota inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno etiquetados con la concentración correcta de proteína a 50 µl por vial y congélelo a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 2000 pg/mL a partir de la solución madre del estándar. Agite en vórtex para mezclar. b. Agregue 300 µL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquetar como 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL y 31,3 pg/mL. c. Realizar diluciones seriadas añadiendo 300 µL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Procedimiento de ensayo recomendado 1. Diluir el anticuerpo de captura 1:250 en tampón de recubrimiento y recubrir los micropocillos con 100 ul de anticuerpo de captura diluido por pocillo. Sellar la placa e incubar durante la noche a 4 °C. No diluir más anticuerpo de captura del necesario para el experimento. 2. Aspirar los pocillos y lavar 5 veces con ≥ 300 µL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invertir la placa y secar sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 µL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a TA durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". Asegúrese de registrar la concentración del estándar reconstituido para futuras consultas. 6. Pipetee 100 µL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Selle la placa e incube durante 2 horas a TA. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 8. Diluya el anticuerpo de detección 1:250 en diluyente de ensayo y añada 100 µL de anticuerpo de detección diluido a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a TA. No diluya más anticuerpo de detección del necesario para el experimento. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 10. Diluya el reactivo enzimático (SAv-HRP) 1:250 en diluyente de ensayo y añada 100 µl de reactivo enzimático diluido a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. No diluya más reactivo enzimático del necesario para el experimento. 11. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este último paso de lavado, sumerja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto por cada lavado. 12. Añada 100 µl de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placas) durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 13. Añada 50 µl de solución de parada a cada pocillo. 14. Lea la absorbancia a 450 nm en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Si dispone de corrección de longitud de onda, reste la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añadir 100 µL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incubar durante la noche a 4 °C. 2. Aspirar y lavar 5 veces. 3. Bloquear las placas: 200 µL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. 4. Aspirar y lavar 5 veces. 5. Añadir 100 µL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 horas a temperatura ambiente. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Añadir 100 µL de Ab de detección diluido a cada pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. 8. Aspirar y lavar 5 veces. 9. Añadir 100 µL de SAv-HRP diluido a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente. 10. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min). 11. Agregar 100 µL de solución de sustrato TMB a cada pocillo. Incubar 30 min RT en oscuridad 12. Agregar 50 µL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm dentro de los 30 min con corrección λ 570 nm. Cálculo de resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Graficar la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de TNF en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de TNF de las incógnitas, encontrar el valor de absorbancia media de la incógnita en el eje y y dibujar una línea horizontal hacia la curva estándar. En el punto de intersección, dibujar una línea vertical hacia el eje x y leer la concentración de TNF. Si las muestras se diluyeron, multiplicar la concentración de TNF por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos por computadora, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se probaron en el ensayo BD OptEIA a ≥ 10 ng/mL y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 15 pg/mL). Humano recombinante: TNF Ratón recombinante: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, GM-CSF, IFN-γ, LTα, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1α, MIP-1β, sTNFRI, sTNFRII, RANTES Rata recombinante: IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-18, GM-CSF, IFN-γ Limitaciones del procedimiento · Las muestras que generan valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado exhaustivamente la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede descartar la posibilidad de interferencia. Los sets BD OptEIA están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del set. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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