BD, 572178, Panel de proteínas de células T BD® OMICS-One

Reactividad: Humana (Probada en desarrollo)
Solicitud: Secuenciación de 3' de células individuales (calificada)
Estado regulatorio: RUO
Tampón de almacenamiento: polvo liofilizado que contiene BSA y ≤ 0,25 % de azida sódica.
Descripción: El panel de proteínas de células T BD® OMICS-One consta de 30 especificidades diferentes contra los principales marcadores de células T en un solo tubo. Diseñado y optimizado para funcionar en el sistema BD Rhapsody™, el panel de proteínas de células T se ha probado para funcionar a la perfección con el ensayo de análisis del transcriptoma completo (WTA) BD Rhapsody™, el ensayo de ARNm dirigido, el kit de multiplexación de células individuales BD® (SMK), el ensayo CITE-seq intracelular BD® (IC-AbSeq) y el ensayo multiómico BD Rhapsody™ TCR/BCR Next para humanos. Cada anticuerpo individual se conjugó con un oligonucleótido que contiene una secuencia de código de barras de anticuerpo específica flanqueada por una cola de poliA en el extremo 3' y un asa de PCR común (sitio de unión del cebador de PCR) en el extremo 5'. Para permitir la corrección de errores de secuenciación y un mapeo único, todas las secuencias de código de barras AbSeq se generaron in silico con una similitud mínima con los genomas humanos, presentan una estructura secundaria predicha baja y una distancia de Hamming alta dentro del portafolio de anticuerpos-oligos de BD. La cola de poliA del oligonucleótido permite que la secuencia de código de barras sea capturada por las perlas de captura celular mejoradas BD Rhapsody™. El asa de PCR de 5' permite una generación eficiente de bibliotecas de secuenciación para diversas plataformas de secuenciación. Cada anticuerpo individual se encuentra en una concentración óptima dentro del plexo de 30, lo que permite una resolución superior tanto del objetivo como de la población. El panel de proteínas de células T está diseñado con tecnología SMART. Esta tecnología ayuda a reducir el coste de secuenciación y a aumentar la resolución de los datos al atenuar los anticuerpos dirigidos a marcadores primarios de alta expresión y al permitir la reasignación de lecturas de secuenciación a marcadores expresados ​​a niveles más bajos. Con la tecnología SMART, los marcadores de baja expresión pueden cuantificarse sin necesidad de realizar una secuenciación más profunda ni incurrir en un coste elevado. Las dos especificidades atenuadas en el panel de proteínas de células T son CD4 y CD44.
Preparación y almacenamiento: Conservar a 2-8 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Este reactivo se proporciona liofilizado en un formato pretitulado. 1. Retire el tubo BD® OMICS-One T-Cell Protein Panel de la bolsa de aluminio y deje que alcance la temperatura ambiente durante 5 minutos. 2. Asegúrese de que el pellet se encuentre en el fondo del tubo. De lo contrario, centrifugue brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo. 3. Añada 35 µL de agua libre de nucleasas al fondo del tubo y deje que los anticuerpos se reconstituyan durante 5 minutos a temperatura ambiente. 4. Transfiera los anticuerpos reconstituidos a hielo hasta que las células estén listas para la tinción. Nota: Reconstituya los anticuerpos inmediatamente antes de la tinción celular. La incubación prolongada del anticuerpo reconstituido puede aumentar el fondo no específico. 5. Para BD® AbSeq Ab-Oligo drop-in de 60 plex o menos, prepare el BD® AbSeq labeling MasterMix en un tubo LoBind de 1,5 mL en hielo. Nota: Para drop-in con más de 60 plex, comuníquese con el soporte técnico para realizar el cálculo. Para el etiquetado secuencial con etiquetas de muestra o sin etiquetas de muestra, prepare la mezcla maestra de etiquetado BD® AbSeq para drop-ins de la siguiente manera: ____________________________________________________________________________________________ Componente 1 muestra (µL) 1 muestra + 2 muestras + 30 % de exceso (µL) 30 % de exceso (µL) Por BD® AbSeq Ab-Oligo 2,0 2,6 5,2 Total de BD® AbSeq Ab-Oligo 2,0 × N* 2,6 × N 5,2 × N FBS † (número de catálogo 554656) 140 – (2,0 x N) 182 – (2,6 x N) 364 – (5,2 x N) Total 140 182 364 Para el etiquetado conjunto con etiquetas de muestra, prepare la mezcla maestra de etiquetado BD® AbSeq para drop-ins de la siguiente manera: ____________________________________________________________________________________________ Componente 1 muestra (µL) 1 muestra + 2 muestras + 30% de exceso (µL) 30% de exceso (µL) Por BD® AbSeq Ab-Oligo 2,0 2,6 5,2 Total de BD® AbSeq Ab-Oligo 2,0 × N* 2,6 × N 5,2 × N FBS † (número de catálogo 554656) 120 – (2,0 × N) 156 – (2,6 × N) 312 – (5,2 × N) Total 120 156 312 * N = número de anticuerpos de inserción directa. N = 0 si no hay anticuerpos de inserción directa. † FBS = tampón de tinción BD Pharmingen™. 6. Pipetee la mezcla maestra de etiquetado BD® AbSeq para gotas. Centrifugue brevemente para recoger el contenido en el fondo y vuelva a colocarla en hielo. 7. Para el etiquetado secuencial con o sin etiquetas de muestra, añada 140 µL de la mezcla maestra de etiquetado BD® AbSeq de gotas al tubo que contiene 35 µL de solución reconstituida del panel de proteínas de células T para cada muestra, hasta alcanzar un volumen total de 175 µL. Para el coetiquetado con etiquetas de muestra, añada 120 µL de la mezcla maestra de etiquetado BD® AbSeq de gotas y 20 µL de etiqueta de muestra al tubo que contiene 35 µL de solución reconstituida del panel de proteínas de células T, hasta alcanzar un volumen total de 175 µL. 8. Pipetee la mezcla, centrifugue brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo y vuelva a colocarla en hielo. 9. Centrifugue las células a 400 × g durante 5 minutos. Si utiliza el Bloqueo Fc, continúe con el paso 10. De lo contrario, vaya al paso 11. 10. (Opcional) Para muestras que contengan linfocitos mieloides y linfocitos B, BD Biosciences recomienda bloquear las señales de falsos positivos mediadas por el receptor Fc inespecífico con el Bloqueo Fc Humano BD (n.° de cat. 564220). Para realizar el bloqueo, pipetee el Fc Block MasterMix en un tubo LoBind nuevo de 1,5 mL en hielo: _________________________________________________________________________________ Componente 1 muestra (µL)* 1 muestra + 20 % de exceso (µL) FBS† (número de catálogo 554656) 20,0 24,0 Fc Block‡ (número de catálogo 564220) 5,0 6,0 Total 25,0 30,0 * Suficiente para hasta 1 millón de células. Para bloquear más células, ajuste el volumen. † FBS = tampón de tinción BD Pharmingen™. ‡ Fc Block = BD Pharmingen™ Human BD Fc Block. b. Pipetee y mezcle el Fc Block MasterMix y centrifugue brevemente. Coloque en hielo. c. Retire el sobrenadante de las células sin alterar el sedimento. d. Resuspenda las células en 25 µL de Fc Block MasterMix. e. Incube las células a temperatura ambiente (15 °C a 25 °C) durante 10 minutos. f. Añada 175 µL de BD® AbSeq labeling MasterMix del paso 8 a la suspensión celular. Pipetee y mezcle y proceda al paso 12. 11. Retire el sobrenadante de las células sin alterar el pellet. Añada 25 µL de tampón de tinción (FBS) a los 175 µL de BD® AbSeq labeling MasterMix del paso 8 para completar un volumen total de 200 µL. Resuspenda el pellet celular en un volumen total de 200 µL. Pipetee y mezcle. 12. Transfiera las células con BD® AbSeq labeling MasterMix a un nuevo tubo Falcon de poliestireno de 5 mL. 13. Teñir las células en hielo durante 30 minutos. 14. Añada 3-4 mL de tampón de tinción (FBS) a las células marcadas y mezcle con la pipeta. 15. Centrifugue a 400 xg durante 5 minutos. 16. Destape el tubo e inviértalo para decantar el sobrenadante en residuos biopeligrosos. Mantenga el tubo invertido y seque suavemente con una toallita sin pelusa para eliminar el sobrenadante residual del borde del tubo. 17. Repita los pasos 14-16 dos veces más para un total de tres lavados. 18. Resuspenda el sedimento celular lavado final en 620 µL de tampón de muestra frío del reactivo de cartucho mejorado BD Rhapsody™ V3 (número de catálogo 667052) y proceda a la captura de células individuales con el lavado en el cartucho descrito en los subpasos a-c. Consulte el Protocolo de Captura de Células Individuales y Síntesis de ADNc del Sistema de Análisis de Células Individuales BD Rhapsody™ HT (Doc ID 23-24252) o el Protocolo de Captura de Células Individuales y Síntesis de ADNc del Sistema BD Rhapsody™ HT Xpress (Doc ID 23-24253) para obtener más información. Nota: Realice el lavado en el cartucho después de la sedimentación celular (incubación de 8 minutos) de la siguiente manera: a. En la sección del protocolo "Carga de células en el Cartucho de 8 Carriles BD Rhapsody™", después de la carga celular, incube el cartucho en oscuridad a temperatura ambiente durante 8 minutos. b. Coloque el cartucho en el BD Rhapsody™ HT Xpress y realice las siguientes operaciones: _____________________________________________________________ Material a cargar Volumen (µL) 1 carril Modo Pipeta Aire 380 Cebado/Lavado Frío Tampón de muestra 380 Cebado/Lavado Aire 380 Cebado/Lavado Frío Tampón de muestra 380 Cebado/Lavado c. (Opcional) Realice el paso del escáner: Escaneo de carga celular, si utiliza el Protocolo de captura de células individuales y síntesis de ADNc del sistema de análisis de células individuales BD Rhapsody™ HT (ID de documento 23-24252). No es necesario un retraso de 8 minutos antes del escaneo. Advertencia: Todas las muestras y materiales biológicos se consideran biopeligrosos. Manéjelos como si fueran capaces de transmitir infecciones y deséchelos utilizando las precauciones adecuadas de acuerdo con las regulaciones federales, estatales y locales. Nunca pipetee con la boca. Use ropa, gafas y guantes de protección adecuados. Lista de las 30 especificidades AbSeq humanas incluidas en el panel de células T BD® OMICS-One: _____________________________________________________________________________ Especificidad Clon Oligo ID BD® AbSeq Código de barras Secuencia CD103 Ber-ACT8 AHS0001 AAATAGTATCGAGCGTAGTTAAGTTGCGTAGCCGTT CD137 4B4-1 AHS0003 TGACAAGCAACGAGCGATACGAAAGGCGAAATTAGT CD45RA HI100 AHS0009 AAGCGATTGCGAAGGGTTAGTCAGTACGTTATGTTG CD69 FN50 AHS0010 CAATAACGGGTCATAGTAAGTCGCGAGTAAGAGGGC CD278 DX29 AHS0012 ATAGTCCGCCGTAATCGTTGTGTCGCTGAAAGGGTT CD134 (OX40) ACT35 AHS0013 GGTGTTGGTAAGACGGACGGAGTAGATATTCGAGGT CD279 (PD-1) EH12.1 AHS0014 ATGGTAGTATCACGACGTAGTAGGGTAATTGGCAGT CD366 (TIM-3) 7D3 AHS0016 TAGGTAGTAGTCCCGTATATCCGATCCGTGTTGTTT CD223 (Lag3) T47-530 AHS0018 CGGCATGAATTAGGCGAGACTTAGTATACGAGCTGG CD95 (Fas) DX2 AHS0023 GGCCCGTTAGAGTTGGTATCCGTATGAAGGTTAGCT CD25 2A3 AHS0026 AGTTGTATGGGTTAGCCGAGAGTAGTGCGTATGATT CD127 HIL-7R-M21 AHS0028 AGTTATTAGGCTCCGTAGGTATGTTTAGGTTATCGCG CD183 1C6/CXCR3 AHS0031 AAAGTGTTGGCGTTATGTGTTCGTTAGCGGTGTGGG CD4 SK3 AHS0032 TCGGTGTTATGAGTAGGTCGTCGTGCGGTTTGATGT CD196 (CCR6) 11A9 AHS0034 ACGTGTTATGGTGTTGTTCGAATTGTGGTAGTCAGT CD45RO UCHL1 AHS0036 TGAGAGGTTATTGGGCGTATGACTTCGGTGATTGTG CD194 (CCR4) 1G1 AHS0038 AATATTAGTGGGTCCTCGCGTTGGCCGGTTGTTAGT CD62L DREG-56 AHS0049 ATGGTAAATATGGGCGAATGCGGGTTGTGCTAAAGT CD272 J168-540 AHS0052 GTAGGTTGATAGTCGGCGATAGTGCGGTTGAAAGCT CD154 TRAP1 AHS0077 TAAGAGGTAAGTGCATTCGGGTATAGGCGTGATTTG CD357 (GITR) V27-580 AHS0104 TCTGTGTGTCGGGTTGAATCGTAGTGAGTTAGCGTG CD28 L293 AHS0138 TTGTTGAGGATACGATGAAGCGGTTTAAGGGTGTGG TCRgd 11F2 AHS0142 CTCGTGGGTTAGGCTTGATCGTAGTTATGTATGGTT CD44 L178 AHS0167 GTGATTGATTAGGACAGTTCGTTGCTTAGTAGTGGG TCR Va24-Ja18 6B11 AHS0175 TTCTGGTTCGGTTGAGCTACTAATTTCGTTGGATGG CD161 (KLRB1) HP-3G10 AHS0205 TTTAGGACGATTAGTTGTGCGGCATAGGAGGTGTTC CD8 SK1 AHS0228 AGGACATAGAGTAGGACGAGGTAGGCTTAAATTGCT CD3 UCHT1 AHS0231 AGCTAGGTGTTATCGGCAAGTTGTACGGTGAAGTCG CD197 (CCR7) 2-L1-A AHS0273 AATGTGTGATCGGCAAAGGGTTCTCGGGTTAATATG TIGIT tgMab-2 AHS0411 AGAGGGTTTAGTCAAGGTCGTGCGTATAGTTCAGGT
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo se proporciona liofilizado en un formato pretitulado. Consulte https://www.bdbiosciences.com/en-us/resources/protocols/single-cell-multiomics para conocer los protocolos técnicos. El proceso de producción se sometió a rigurosas pruebas y validación para garantizar que genera un conjugado de alta calidad con un rendimiento consistente y una actividad de unión específica. Sin embargo, no se han realizado pruebas de verificación en todos los lotes de conjugado. Vaya a https://abseq-ref-gen.genomics.bd.com/ para acceder a los archivos de referencia de AbSeq en formato FASTA para análisis bioinformáticos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Siga las pautas estatales y locales al desechar residuos peligrosos. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Para consultar las patentes estadounidenses aplicables, consulte bd.com/patents. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS).