BD, 559073, Control de isotipo IgG2a κ de rata purificado BD Pharmingen™

Isotipo: LOU de rata, también conocida como Louvain, LOU/C, LOU/M IgG2a, κ
Inmunógeno: Inmunoglobulina agrupada de ratón
Aplicación: Control de isotipo (probado rutinariamente), inmunohistoquímica-formalina (requiere recuperación de antígeno), inmunohistoquímica-congelado, inmunohistoquímica-fijado con zinc (probado durante el desarrollo)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_479682
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. Conservar sin diluir a 4 °C.
Procedimientos de ensayo recomendados: Inmunocitoquímica: El formato ICC del anticuerpo purificado R35-95 (n.º de cat. 559073) es un control de isotipo de inmunoglobulina para IgG2a de rata y puede utilizarse para determinar el nivel de tinción de fondo no específica en un ensayo inmunocitoquímico indirecto de citocinas. El anticuerpo purificado R35-95 debe utilizarse a la misma concentración que el anticuerpo específico primario y visualizarse en las mismas condiciones mediante un procedimiento de tinción de tres pasos en combinación con IgG de cabra anti-rata con biotina (n.º de cat. 559286) y estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. A continuación, se detalla el protocolo para el procedimiento inmunocitoquímico de citocinas. REACTIVOS REQUERIDOS PARA EL PROTOCOLO DE INMUNOCITOQUÍMICA DE CITOQUINAS 1. Tampón de fijación: se disuelve formalina al 5% (formalina al 10%, CMS, n.º de cat. 245-684) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón Bacto FA, Difco Laboratories, n.º de cat. 2314-15-0) o tampón de fijación ICC de BD Pharmingen™ (n.º de cat. 550010). 2. Tampón bloqueador de peroxidasa endógena: reactivo bloqueador de peroxidasa DAKO (DAKO, n.º de cat. S2001). 3. Tampón bloqueador de biotina endógena: kit bloqueador de biotina/avidina (Vector Laboratories, n.º de cat. SP-2001). 4. Tampón de dilución de anticuerpos: diluyente de anticuerpos para IHC de BD Pharmingen, n.º de cat. No. 559148, suplementado con saponina 5. Portaobjetos microscópicos: portaobjetos de adhesión (Erie Scientific Company, cat. n.º ER-202B-AD) o para citocentrifugaciones, portaobjetos Colorfrost/Plus (Fisher, cat. n.º 12-550-17). 6. Anticuerpo de segundo paso: IgG de cabra anti-rata con biotina (cat. n.º 559286) 7. Sistema de detección: BD™ Pharmingen estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) cat. n.º 550946. 8. Kit de sustrato DAB BD Pharmingen™ (contiene tetraclorhidrato de diaminobencidina), cat. n.º 550880 9. Medio de montaje para almacenamiento a corto plazo: Aqua-mount (Lerner Laboratories, cat. n.º 13800). PROCEDIMIENTO PARA LA TINCIÓN INMUNOCITOQUÍMICA DE PREPARACIONES DE CÉLULAS INDIVIDUALES Este procedimiento describe la técnica inmunoenzimática de tinción de citocinas dentro de células individuales que se inmovilizan en portaobjetos microscópicos mediante adherencia (portaobjetos adherentes) o centrifugación (citocentrifugación). PORTAOBJETOS DE ADHERENCIA 1. Coseche las células y lávelas dos veces en PBS mediante centrifugación (400 xg durante 5 min) para eliminar la proteína residual. 2. Ajuste la concentración celular a 4-5x10^6 células/ml en PBS. 3. Coloque 20 µl de la suspensión celular en cada pocillo de los portaobjetos de adhesión y deje que se adhieran a temperatura ambiente (TA) durante 20 min. Tenga en cuenta que los portaobjetos deben lavarse en PBS a TA durante 5 min antes de transferir las células. 4. Fije las células en los portaobjetos utilizando tampón de fijación durante 15 min a TA. 5. Lave los portaobjetos 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 6. Bloquee los portaobjetos con PBS suplementado con 1% (p/v) BSA (Sigma, Cat. #A43-78) durante 30 min a TA o 10 min a 37 °C. 7. Lave los portaobjetos 2X en PBS y proceda con la tinción o séquelos al aire y guárdelos a -80 °C para uso futuro. 8. Incube los portaobjetos con 20 µl de suero de cabra al 1% y PBS con 0,1% (p/v) de saponina durante 30 min a TA. 9. Lave los portaobjetos 2X con PBS con incubaciones de 5 min. 10. Bloquee la actividad de peroxidasa endógena con tampón bloqueador de peroxidasa endógena (20 µl/pocillo) durante 10 min a TA. 11. Lave 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 12. Incube cada pocillo con avidina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 13. Lavar 2X en PBS con 5 min de incubación. 14. Incubar cada pocillo con biotina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 15. Lavar 2X en PBS con 5 min de incubación. 16. Incubar cada pocillo durante 1 h a temperatura ambiente con 20 µl de anticuerpo específico de citocina purificado o control de isotipo de inmunoglobulina adecuado diluido en tampón diluyente de IHC de Pharmingen suplementado con saponina. 17. Lavar los portaobjetos 2X en PBS con 5 min de incubación. 18. Incubar cada pocillo con 20 µl de un anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón diluyente de IHC durante 30 min a temperatura ambiente. 19. Lavar 2X en PBS con 5 min de incubación. 20. Aplicar 20 µl de estreptavidina-HRP (BD Cat. No. 550946) a cada pocillo de los portaobjetos e incubar durante 30 min a TA. 21. Lavar los portaobjetos 2X con PBS con incubaciones de 5 minutos. 22. Incubar con sustrato DAB según el prospecto del producto durante menos de 5 min a TA. 23. Detener el desarrollo de la reacción de color lavando con PBS. 24. Los portaobjetos se montan posteriormente en un medio de montículo de almacenamiento a corto plazo. CYTOSPINS 1. Montar la cámara de muestra de Cytospin (p. ej. Cytospin 3, Shandon, Reino Unido o una centrífuga comparable), la tarjeta de filtro, el portaobjetos y los bastidores de citocentrifugación según las especificaciones del fabricante. 2. Cargar 40 µl de aproximadamente 1 x 10^6 células en cada cámara de muestra. 3. Centrifugar los portaobjetos a 600 rpm durante 2 min. 4. Retire los portaobjetos del soporte de citocentrifugación y colóquelos en un soporte de tinción. 5. Para la fijación y tinción, siga los pasos 4 a 24 especificados anteriormente para la tinción de células en portaobjetos de adhesión.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.