BD, 560747, Panel de detección de marcadores de superficie celular humanos BD Lyoplate™

Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_1953343
Descripción: Descripción El panel de cribado de marcadores de superficie celular humana BD Lyoplate™ contiene 242 anticuerpos monoclonales purificados para marcadores de superficie celular. El panel también contiene controles de isotipo de ratón y rata para evaluar el fondo específico del isotipo. El panel se puede utilizar para el cribado de líneas celulares, células primarias o tejido, y es compatible con plataformas de tecnología de citometría de flujo y bioimagen. El panel contiene tres (3) placas de 96 pocillos, cada pocillo con 2,75 µg de anticuerpo, suficiente para cinco pruebas (0,5 µg/prueba) junto con anticuerpos secundarios de cabra anti-Ig de ratón y cabra anti-Ig de rata conjugados con AlexaFluor® 647. Este producto es compatible con células que expresan genes reporteros fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP) y se puede utilizar con anticuerpos adicionales que reconocen la superficie celular y las moléculas intracelulares. Los resultados positivos de los cribados se pueden seguir con anticuerpos purificados o conjugados con fluorcromo ofrecidos por BD Biosciences. Para acceder a este contenido, puede buscar el nombre del clon y/o el nombre de la especificidad en nuestro sitio web: http://www.bdbiosciences.com Componente 51-9006585AK - Panel de marcadores de superficie de células humanas - Parte A ·Placa Lyoplate 1 de marcador de superficie de células humanas (1 de cada una) ·Placa Lyoplate 2 de marcador de superficie de células humanas (1 de cada una) ·Placa Lyoplate 3 de marcador de superficie de células humanas (1 de cada una) ·Almacene las placas sin abrir a temperatura ambiente (18-25 °C). ·Los anticuerpos se liofilizan en una solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤ 0,09 % de azida sódica. Componente 51-9006588BK - Panel de Cribado de Marcadores de Superficie Celular Humanos - Parte B ·AlexaFluor® 647 Goat Anti-Mouse Ig (1,8 ml) ·AlexaFluor® 647 Goat Anti-Rat Ig (0,6 ml) ·Conserve los anticuerpos secundarios a 4 °C. ·Los anticuerpos secundarios se proporcionan en una solución tamponada acuosa que contiene ≤ 0,09 % de azida sódica. Es importante tener en cuenta que los anticuerpos presentes en este panel podrían no reconocer todas las isoformas de cada marcador de superficie celular. Además, los clones de anticuerpos pueden comportarse de forma diferente en los tipos de células según la disponibilidad de epítopos presentes; es decir, ciertos epítopos pueden ocluirse por modificaciones postraduccionales. Los resultados que obtenga en este cribado podrían ser relevantes únicamente para los clones de anticuerpos analizados.
Procedimientos de ensayo recomendados: Instrucciones importantes antes de comenzar: No retire las placas de las bolsas de aluminio hasta que estén listas para usar. La bolsa de aluminio es la principal barrera contra la humedad. Una vez retiradas las placas de las bolsas, los anticuerpos deben reconstituirse. Antes de retirar el precinto de aluminio, asegúrese de centrifugar las placas y tenga cuidado al retirarlo. Consulte la sección "Reconstitución del anticuerpo" a continuación para obtener más información. Después de retirar el precinto de aluminio y antes de la reconstitución, evite colocar la tapa de plástico o cualquier otra cubierta sobre las placas, o volver a sellarlas con un precinto adhesivo. En cualquier caso, la estática resultante puede provocar que las partículas se desprendan y se salgan de los pocillos. Puede observar que no todas las partículas liofilizadas tienen el mismo aspecto físico. Esto es normal y no afectará el rendimiento de los anticuerpos. Algunos marcadores de superficie celular son sensibles a la digestión enzimática. Siempre que sea posible, utilice un tampón de disociación celular no enzimático para preparar las células para la citometría de flujo. Para la disociación celular enzimática de líneas celulares, recomendamos usar Accutase™ (n.° de cat. 561527). Asegúrese de que las células estén en una suspensión celular única. Un tratamiento con DNasa y la adición de EDTA al tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.° de cat. 554656) mitigarán la agregación celular. Algunos anticuerpos contra marcadores de superficie celular pueden producir artefactos (falsos positivos y negativos) en células fijadas. Si la fijación es necesaria, la tinción de células vivas con fijación posterior antes del análisis puede ayudar a reducir estos artefactos. Si bien la mayoría de los anticuerpos del panel se obtuvieron en ratones, algunos se obtuvieron en ratas; estos se encuentran en la placa 3, en los pocillos F1-F12, G1 y G1-G4 (pocillos rojos en el mapa de la placa 3). Asegúrese de utilizar un anticuerpo secundario anti-Ig de rata con las células teñidas con estos anticuerpos. Recomendamos evaluar la tinción de fondo de las células titulando los anticuerpos secundarios Alexa Fluor® 647 antes de intentar un cribado completo. Se ha proporcionado un exceso de anticuerpos secundarios. Según los tipos celulares analizados, recomendamos utilizar los anticuerpos secundarios antirratón y antirata a una concentración de 1,25 µg/ml (100 µl por pocillo). Recomendamos los siguientes controles negativos: (1) células sin teñir, (2) células + anticuerpo secundario antirratón y (3) células + anticuerpo secundario antirata. Para este fin, se proporcionan pocillos en blanco (etiquetados como "tampón" en los mapas de la placa). Para el análisis por citometría de flujo, recomendamos procesar de 500.000 a 1.000.000 de células por pocillo para obtener mejores resultados. Sin embargo, hemos tenido éxito procesando tan solo 250.000 células por pocillo. Para el análisis por citometría de flujo, recomendamos utilizar un cargador de placas HTS de 96 pocillos. Sin embargo, también hemos tenido éxito transfiriendo células teñidas de placas de 96 pocillos a tubos de fondo redondo BD Falcon™ de 12 x 75 mm (n.º de cat. 352008) y utilizando un cargador manual para procesar las muestras. Reconstitución del anticuerpo: ·Después de retirar las placas BD Lyoplate Human Cell Surface Marker Screening Panel de las bolsas de aluminio, centrifugue a 300 X g durante 5 minutos. ·Sujete la placa firmemente sobre la mesa de trabajo y retire con cuidado el sello de aluminio comenzando por un extremo y tirando a lo largo de la placa para retirar completamente el sello. Una vez retirado el sello de aluminio, todos los anticuerpos liofilizados deben reconstituirse inmediatamente. No vuelva a colocar la tapa en la placa antes de la reconstitución. ·Usando una pipeta multicanal, reconstituya los anticuerpos liofilizados en 110 µl de PBS estéril 1X. Esto da como resultado una solución de anticuerpos que contiene cinco pruebas (20 µl/prueba). Asegúrese de utilizar puntas de pipeta nuevas para cada fila para evitar la contaminación de pocillo a pocillo. Deje que los anticuerpos se reconstituyan durante cinco minutos a temperatura ambiente. Conserve los anticuerpos reconstituidos a 4 °C hasta que las células estén preparadas para los experimentos. Los anticuerpos reconstituidos pueden conservarse en placas con tapa a 4 °C durante al menos 10 días. Selle los bordes de la placa (con la tapa puesta) con película de laboratorio Parafilm "M"® para evitar la pérdida del anticuerpo reconstituido por evaporación. Cribado celular mediante citometría de flujo: 1. Prepare una suspensión unicelular de células vivas de una línea celular, tejido o cultivo tridimensional. Para líneas celulares adherentes, recomendamos utilizar una enzima suave como Accutase™ o un tampón de disociación no enzimático. 2. Lave las células con dos a cuatro volúmenes de PBS 1X. Centrifugue a 300 X g durante 5 minutos. 3. Elimine cualquier grumo pasando las células a través de un filtro celular BD Falcon™ de 40 o 70 µm (n.° de cat. 352340, n.° de cat. 352350). 4. Determine la concentración celular y el número total de células. Si está disociando tejido o un cultivo tridimensional, recomendamos tratar las células individuales con DNasa para evitar la aglutinación celular. Resuspenda las células en el medio de cultivo recomendado o en PBS 1X con calcio y magnesio, añadiendo 100 unidades/ml de DNasa a 10 millones de células por ml. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. 5. Lave las células en dos a cuatro volúmenes de PBS 1X. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. 6. Prepare 275 ml de tampón de tinción BD Pharmingen (FBS) con EDTA 5 mM (concentración final) para los pasos posteriores. 7. Resuspenda la muestra en tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA. Necesitará de 135 a 270 millones de células (en un volumen total aproximado de 27 ml) para llenar los pocillos que contienen anticuerpos de las tres placas (500.000-100.000 células por pocillo). El número mínimo de células por pocillo dependerá del citómetro y/o de la pérdida de células durante el lavado. Hemos logrado procesar tan solo 250.000 células por pocillo. 8. Etiquete las placas 1, 2 y 3 de las tres placas BD Falcon™ de 96 pocillos de fondo redondo (n.° de cat. 353910) para sus placas de muestra. 9. Con una pipeta multicanal, alícuota 100 µl de solución celular en los pocillos necesarios de las tres placas de 96 pocillos de fondo redondo etiquetadas. a. Si tiene un número limitado de células, puede omitir los pocillos de solo tampón de la placa 3. Consulte el mapa de la Placa 3 para identificar los pocillos que pueden excluirse teniendo en cuenta las células sin teñir y los controles de anticuerpos secundarios. 10. Con una pipeta multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para mezclar completamente el anticuerpo reconstituido de la primera fila de pocillos de la Placa 1 del Panel de Cribado BD Lyoplate. Agregue 20 µl a las células en los pocillos correspondientes de la placa de muestra 1. Continúe agregando el anticuerpo reconstituido a los pocillos de muestra correspondientes para todos los pocillos restantes de cada placa. Use puntas nuevas para cada pocillo. Incube en hielo durante 20-30 minutos. 11. Para lavar, agregue 100 µl de tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA a cada pocillo. Centrifugue a 300 X g durante 5 minutos. 12. Retire el sobrenadante cuidadosamente y lave las células con 200 µl adicionales de tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. 13. Durante la centrifugación del lavado final, diluya el anticuerpo secundario en una dilución 1:200 (1,25 µg/ml) en tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA. Necesitará aproximadamente 26 ml de anticuerpo secundario antirratón diluido y aproximadamente 3 ml de anticuerpo secundario antirata diluido. 14. Retire el sobrenadante y aplique 100 µl del anticuerpo secundario apropiado directamente a las células de cada pocillo e incube durante 20-30 minutos en hielo en la oscuridad. a. Añada el anticuerpo secundario antirratón a todos los pocillos de las dos primeras placas de muestra de 96 pocillos de fondo redondo marcadas. Para la placa de muestra 3, consulte los mapas de placas y añada el anticuerpo secundario antirratón a los pocillos de muestra correspondientes (pocillos blancos: todos los pocillos de las filas A, B y C, pocillos D1-D5 y E1-E5) y añada el anticuerpo secundario antirata a los pocillos correspondientes (pocillos rojos: pocillos F1-F12 y G1-G4). b. Utilice los pocillos restantes de la placa de muestra 3 que no contengan anticuerpo (pocillos grises) para preparar células sin teñir y controles de anticuerpo secundario antirata. 15. Para lavar, añada 100 µl de tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA a cada pocillo. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. 16. Retire el sobrenadante y lave las células con 200 µl adicionales de tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. 17. En este punto, puede que desee fijar las células antes del análisis. Para ello, retire el sobrenadante y añada 100 µl de paraformaldehído al 4 % en PBS 1X o tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655) por pocillo e incube durante 10 minutos. Si no desea fijar las células, vaya al paso 19. 18. Lave las células dos veces con PBS 1X. Centrifugue a 300 x g durante 5 minutos. 19. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 150 µl de tampón de tinción BD Pharmingen + EDTA por pocillo. Analice las muestras en un citómetro de flujo. Recomendamos recolectar al menos 10 000 eventos por pocillo. Mientras se lee la primera placa, guarde las demás en hielo y en la oscuridad. 20. Las plantillas de análisis están disponibles en bdbiosciences.com/resources/stemcell, en la sección Herramientas. Cribado celular mediante bioimagen: 1. Siembre las células en un medio de cultivo adecuado a una densidad celular adecuada en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.° de cat. 353219) y cultive las células hasta alcanzar la densidad adecuada. Recomendamos una confluencia del 70-80 % para el cribado mediante imágenes. 2. La tinción de la superficie de BD Lyoplate debe realizarse en células vivas, ya que la fijación puede causar artefactos (falsos positivos y negativos) con algunos marcadores de superficie celular. En los casos en que las células deban fijarse antes de la tinción, recomendamos confirmar cualquier resultado positivo con una tinción de muestra viva mediante citometría de flujo o de imagen. 3. Con una pipeta multicanal, añada 20 µl de cada anticuerpo reconstituido a los pocillos correspondientes de las placas de muestra e incube en hielo durante 20-30 minutos. Tiñe las células directamente en 50 a 100 µl de medio de cultivo fresco. Si tiñe células fijadas, tiñe las células en PBS 1X. 4. Lave las células dos veces en 100 µl de PBS 1X. 5. Diluya los anticuerpos secundarios a 1:100 (2,5 µg/ml) en medio de cultivo y aplique 100 µl del anticuerpo secundario apropiado directamente a las células en cada pocillo de las placas de muestra. Incube durante 20-30 minutos en hielo en oscuridad. Necesitará aproximadamente 26 ml de anticuerpo secundario antirratón diluido y aproximadamente 3 ml de anticuerpo secundario antirata diluido. a. Añada el anticuerpo secundario antirratón a todos los pocillos de las dos primeras placas de muestra de 96 pocillos marcadas. Para la placa de muestra 3, consulte los mapas de placas y agregue anticuerpo secundario antirratón a los pocillos de muestra apropiados (pocillos blancos: todos los pocillos en las filas A, B y C pocillos D1-D5 y E1-E5) y agregue anticuerpo secundario antirata a los pocillos apropiados (pocillos rojos: pocillos F1-F12 y G1-G4). b. Use los pocillos restantes en la placa de muestra 3 que no contienen anticuerpo (pocillos grises) para configurar células sin teñir y controles de anticuerpo secundario antirata. 6. Retire el sobrenadante y lave las células dos veces en 100 µl de PBS 1X. 7. En este punto, puede que desee fijar sus células antes del análisis. Para fijar, retire el sobrenadante y agregue 100 µl de paraformaldehído al 4% en PBS 1X o tampón de fijación BD Cytofix por pocillo e incube durante 10 minutos. Si no desea fijar sus células, vaya al paso 9. 8. Retire el fijador de los pocillos y lávelos dos veces con 100 µl de PBS 1X. 9. Agregue 100 µl de PBS 1X con un tinte de ácido nucleico permeable a las células, como la solución Hoechst 33342 (n.º de cat. 561908). 10. Analice sus muestras en un bioimagenador de alto contenido. Productos complementarios sugeridos Descripción - Tamaño - Número de catálogo Tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) - 500 ml - 554656 Tampón de fijación BD Cytofix™ - 100 ml - 554655 BD Accutase™ - 100 ml - 561527 Solución BD Pharmingen™ Hoechst 33342 - 1 mg/ml - 561908 Productos relacionados Descripción - Tamaño - Número de catálogo Microplacas BD Falcon™ de 96 pocillos, negras/transparentes con tapa, para ensayos de imágenes de alto contenido - 32/caja - 353219 Microplacas BD Falcon de 96 pocillos, fondo redondo, sin tapa, para análisis de citometría de flujo de alto rendimiento - 50/caja - 353910 Tapas de baja evaporación BD Falcon para BD Falcon de 96 pocillos Microplacas - 50/caja - 353071 Advertencias y precauciones: El panel de cribado de marcadores de superficie de células humanas (Parte A), que contiene las placas Lyoplates 1, 2 y 3, contiene azida sódica. Los investigadores deben tener en cuenta las siguientes declaraciones de riesgo y seguridad: Símbolos de peligro - Componentes determinantes de peligro del etiquetado: Nocivo por inhalación - Azida sódica Xn. Frases de riesgo. Frases de seguridad: Nocivo en contacto con la piel. 36. Usar ropa protectora adecuada. 22. Nocivo por ingestión. 60. Este material y su envase deben eliminarse como residuos peligrosos. Mostrar menos.
Avisos de producto: Avisos de producto Alexa Fluor® es una marca registrada de Life Technologies Corporation. Este producto se proporciona bajo una licencia de propiedad intelectual entre Life Technologies Corporation y BD Businesses. La compra de este producto transmite al comprador el derecho intransferible de usar la cantidad comprada del producto y los componentes del producto en la investigación realizada por el comprador (ya sea el comprador una entidad académica o con fines de lucro). El comprador no puede vender o transferir de otra manera (a) este producto (b) sus componentes o (c) materiales hechos con este producto o sus componentes a un tercero o de otra manera usar este producto o sus componentes o materiales hechos con este producto o sus componentes para fines comerciales. Fines comerciales significa cualquier actividad realizada por una parte a cambio de una contraprestación y puede incluir, pero no se limita a: (1) uso del producto o sus componentes en la fabricación; (2) uso del producto o sus componentes para proporcionar un servicio, información o datos; (3) uso del producto o sus componentes para fines terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos; o (4) reventa del producto o sus componentes, independientemente de si dicho producto o sus componentes se revenden para su uso en investigación. Para obtener información sobre la compra de una licencia de este producto para cualquier otro uso, comuníquese con Life Technologies Corporation, Cell Analysis Business Unit Business Development, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE. UU., Tel.: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0504. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recopila con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Este producto puede estar cubierto por la patente estadounidense n.º 5.543.320. Patente estadounidense n.º 5.994.515, Universidad de Pensilvania. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Mostrar menos
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 5.0 : N/D : N/D