BD, 550474, BD Pharmingen™ APC Anexina V

Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_2868885
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados La APC Anexina V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10e2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de la APC Anexina V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de la APC Anexina V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de la APC Anexina V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar la Anexina V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar APC Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat.No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 x 10e6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de APC Annexin V para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN DE APC ANEXIN V Reactivos 1. APC Annexin V: Incluido. Utilice 5 µl por prueba. 2. 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD): No incluido. El 7-AAD (n.º de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar, con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Alternativamente, puede adquirir el número de catálogo 556454. Tinción: 1. Lave las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspéndalas en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10⁻¹ células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 x 10⁻¹ células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añada 5 µl de anexina V de APC (para análisis de uno y dos colores) y 5 µl de 7-AAD (solo para análisis de dos colores). 4. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a TA (25 °C) en la oscuridad. 5. Añada 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analice mediante citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con APC Anexina V (sin 7-AAD). 3. Células teñidas solo con 7-AAD (sin APC Anexina V). Otros controles de tinción Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a sufrir apoptosis para obtener una tinción de control positiva con APC Anexina V o APC Anexina V y 7-AAD. Es importante tener en cuenta que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un porcentaje menor de células que son positivas para la apoptosis (APC Anexina V positiva, 7-AAD negativa o APC Anexina V positiva, 7-AAD positiva). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células que han sido inducidas a sufrir apoptosis se determina entonces restando el porcentaje de células apoptóticas en la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas en la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de las células que sufren apoptosis, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se tiñerán positivamente para 7-AAD, así como para APC Anexina V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido una muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, porque en cualquier caso las células muertas se teñirán tanto con APC Anexina V como con 7-AAD.
Avisos del producto: Debido a que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Este reactivo conjugado con APC se puede utilizar en cualquier citómetro de flujo equipado con láser de colorante, HeNe o diodo rojo. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors.