BD, 550487, Kit ELISA de isotipado de inmunoglobulina de ratón BD Pharmingen™

Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2868886
Descripción: El kit ELISA para isotipado de inmunoglobulina de ratón permite la identificación rápida y eficiente de isotipos de inmunoglobulina de ratón. Este kit emplea un sistema de marcado directo con peroxidasa de rábano picante y el formato de ensayo elimina la necesidad de recubrir la placa con antígeno. Estas características conducen a una reducción significativa en el tiempo de ensayo sin sacrificar la sensibilidad. Cada kit suministra: 8 anticuerpos monoclonales de rata específicos para isotipos de inmunoglobulina de ratón, un anticuerpo de rata anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), soluciones de sustrato/parada, tampones de recubrimiento/bloqueo y una mezcla de antígeno de referencia positiva. La mezcla de antígeno de referencia positiva es una mezcla de inmunoglobulinas monoclonales de ratón purificadas de nueve combinaciones de isotipos de cadena pesada y ligera de Ig (IgG1κ, IgG1λ, IgG2aκ, IgG2aλ, IgG2bκ, IgG3κ, IgMκ, IgAκ e IgAλ). Materiales proporcionados:
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con HRP en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y la HRP libre.
Procedimientos de ensayo recomendados: Materiales necesarios pero no proporcionados: Placas de microtitulación de poliestireno o PVC de grado ELISA de 96 pocillos; también se aceptan tiras modulares Pipetas de precisión capaces de administrar entre 50 y 200 µl de Tween-20 al 0,05 % en PBS como solución de lavado Preparación de reactivos: 1. Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) antes de usar. 2. Tampón de recubrimiento (PBS 1X): diluya la cantidad necesaria de PBS 10X con agua desionizada o destilada, mezcle (50 ml para cada placa). 3. Tampón de bloqueo: diluya la cantidad necesaria de BSA al 10 % 1:10 con PBS 1X (35 ml para cada placa). 4. Diluya la mezcla de antígeno de referencia positiva 1:50 con tampón de bloqueo (1 ml para cada placa). 5. Diluya el anticuerpo monoclonal antirratón de rata marcado con HRP 1:100 con tampón de bloqueo (10 ml para cada placa). 6. Solución de sustrato: 15 minutos antes de usar, mezcle volúmenes iguales de reactivo de sustrato A y reactivo de sustrato B (5 ml de cada solución para cada placa) en un tubo o matraz de vidrio limpio. Prepare solo la cantidad necesaria para cada prueba. Deseche cualquier solución de trabajo restante después de usar. Recubrimiento de anticuerpos: Nota: Para obtener resultados óptimos, las cantidades necesarias de anticuerpos de recubrimiento purificados deben diluirse inmediatamente antes de usar, y los anticuerpos diluidos no deben almacenarse durante un período prolongado. Las alícuotas diluidas no deben congelarse. 7. Diluya una cantidad adecuada de cada anticuerpo monoclonal purificado antirratón de rata específico de isotipo en tampón de recubrimiento y distribuya 50 µl de cada reactivo en las filas correspondientes (consulte la figura 1 para ver el diseño sugerido). 8. Golpee suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de la solución de anticuerpos en el fondo de los pocillos. 9. Incubar, cubierto, a 37 °C durante 1 hora o a 4 °C durante la noche. 10. Usar solución de lavado (0,05 % Tween-20 en PBS) para lavar el contenido de la placa usando un lavador de placas o un dispositivo similar y teniendo cuidado de no contaminar de forma cruzada los pocillos con diferentes anticuerpos de captura. Luego, agitar el contenido restante y secar el exceso con una toalla de papel limpia. Repetir el lavado 3 veces. 11. Agregar 200 µl de tampón de bloqueo (ver Preparación de reactivos, paso 3) a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 12. Para preparar el paso 13, lavar 3 veces, agitar el tampón de bloqueo y secar. Incubación de la muestra: 13. Pipetear 100 µl de cada muestra (por ejemplo, sobrenadante de cultivo de hibridoma) que se va a analizar en las columnas de placa adecuadas e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se deben incluir controles positivos (ver Preparación de reactivos, paso 4) según se desee; controles negativos generalmente consisten en sobrenadante de cultivo de mieloma parental (ver Figura 1 para diseño sugerido). 14. Para preparar para el Paso 15, lavar 3X, sacudir el contenido restante y secar. Incubación de conjugado enzimático: 15. Pipetear 100 µl de solución de mAb Ig antirratón de rata marcado con HRP (ver Preparación de reactivos, Paso 5) a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. 16. Para preparar para el Paso 17, lavar 6X, remojando los pocillos durante 30 segundos a 1 minuto en cada lavado. Es muy importante un lavado minucioso en este paso. Desarrollo de color: 17. Agregar 100 µl de solución de sustrato preparada (ver Preparación de reactivos, Paso 6) a cada pocillo e incubar la placa durante 3 a 10 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos de reacción positivos desarrollarán un color azul verdoso. Los pocillos negativos serán incoloros. 18. Pipetee 50 µl de solución de parada en cada pocillo. Los pocillos positivos se volverán amarillos. Lectura del resultado de la placa: 19. Lea visualmente o espectrofotométricamente a 450 nm. Si la corrección de longitud de onda está disponible, reste A (570 nm) de A (450 nm). La figura 2 es un ejemplo de la lectura visual para inmunoglobulinas de varios isotipos. Peligro: El reactivo de sustrato B (componente 51-04141E) contiene 33,05 % de metanol (p/p). Indicaciones de peligro Líquido y vapores inflamables. Tóxico en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación. Provoca daños en el sistema nervioso central. Vía de exposición: Oral. Consejos de precaución Mantener alejado del calor, chispas, llamas abiertas y superficies calientes. - No fumar. En caso de incendio: Utilice medios de extinción adecuados para extinguir. Use guantes/protección ocular. Use ropa protectora. No respire la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuáguese la piel con agua/dúchese. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. EN CASO DE exposición o sospecha: Llamar a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico. Almacenar en un lugar bien ventilado. Mantener el recipiente perfectamente cerrado. Peligro: La solución de parada (componente 51-04161E) contiene 15,23 % de ácido fosfórico (p/p). Indicaciones de peligro Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. Consejos de precaución Llevar guantes/protección ocular. Llevar ropa protectora. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuáguese la piel con agua/dúchese. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. Eliminar el contenido/el recipiente de conformidad con la normativa local/regional/nacional/internacional. Advertencia: HRP Rat Anti-Mouse Ig (100x) (componente 51-04317E) contiene 0,004 % (p/p) y la solución de BSA al 10 % (componente 51-04181E) contiene 0,003 % (p/p) de una mezcla de CMIT/MIT (3:1), que es una mezcla de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 247-500-7] y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 220-239-6] (3:1). Indicaciones de peligro Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Consejos de precaución Llevar guantes/protección ocular. Llevar ropa de protección. Evitar respirar la niebla/los vapores/el aerosol. En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Eliminar el contenido/recipiente de acuerdo con las regulaciones locales/regionales/nacionales/internacionales.
Avisos del producto: ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.