BD, 550750, BD™ DimerX DimerX I: proteína de fusión dimérica soluble recombinante de ratón H-2K[b]:Ig

Isotipo: IgG1 de ratón, λ
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2868900
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. La proteína H-2K[b] se expresó junto con la β2M humana en la línea celular de plasmocitoma de ratón J558L (ATCC TIB-6). Las cadenas polipeptídicas H-2K[b] y β2 se asocian de forma no covalente como consecuencia de su coexpresión en las células J558L. La proteína de fusión H-2K[b]:Ig se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular mediante cromatografía de afinidad. La pureza de la preparación se confirmó mediante SDS-PAGE.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Esta proteína de fusión H-2K[b]:Ig se ha probado mediante tinción inmunofluorescente (≤ 4 µg H-2K[b]:Ig/millón de células) (ver Figura) y análisis de citometría de flujo de células T específicas de antígeno para asegurar la especificidad y reactividad. Es necesario cargar las porciones H-2K[b] de la proteína dimérica con un péptido relevante de interés antes de la tinción inmunofluorescente de las células T. Los complejos H-2K[b]:Ig se cargan eficazmente mediante incubación con exceso de péptidos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (ver Protocolo 1). H-2Kb:Ig cargado con péptidos puede usarse para tinción inmunofluorescente (ver Protocolo 2). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de péptidos de la proteína dimérica H-2K[b]:Ig Un clon de célula T alorreactiva, 2C, es específico para un péptido endógeno, p2Ca. Se han identificado varios péptidos relacionados o análogos de péptidos. Estos difieren en su restricción de MHC y en su afinidad por 2C TCR. Para H-2Kb, el péptido SIY también puede ser reconocido por 2C TCR en el contexto de H-2K[b]. SIY tiene una afinidad relativamente alta por H-2K[b] y se sugiere como un control positivo para la tinción de células 2C en este ensayo. El clon 2C se obtuvo originalmente mediante la estimulación de células de bazo BALB/c con células P815 (H-2Ld) irradiadas. Se han descrito varios protocolos de carga de péptidos. El método utilizado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva de exceso de péptido en solución con proteína H-2K[b]:Ig. Hemos descubierto que la carga pasiva funciona especialmente bien en el caso de péptidos de alta afinidad. Para péptidos de menor afinidad, un aumento en la razón molar de péptido a H-2K[b]:Ig puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo. Se sugiere que para cada péptido, el investigador determine empíricamente parámetros como la dosis de H-2K[b]:Ig por millón de células, la razón molar de péptido a H-2K[b]:Ig y el tiempo de carga del péptido. Si bien este producto BD DimerX contiene β2 Microglobulina, para los investigadores que requieren un exceso de β2 Microglobulina Humana recombinante, recomendamos BD Biosciences Cat. No. 551089. Preparación y carga de péptidos: 1. Será necesario determinar el peso molecular (PM) del péptido de interés. El PM de un péptido se puede estimar multiplicando su número (n) de aminoácidos (AA) por 130 daltons (d) por aminoácido: PM del péptido (d) = n (AA) x 130 (d/AA) 2. Se puede preparar una reserva de péptido a 20 mg/ml en DMSO. Diluya la solución de péptido a 2 mg/ml en DPBS estéril, pH 7,2 para usar en el protocolo de carga de H-2K[b]:Ig. 3. Mezcle la proteína H-2K[b]:Ig con el péptido específico o de control en un exceso molar (M) de 40, 160 o 640. Se puede utilizar el siguiente cálculo, utilizando un péptido de 8 aminoácidos (8mer) como ejemplo: Dp = Peso molecular del péptido: p. ej., 8 aminoácidos x 130 = 1040 daltons. DK[b] = Peso molecular de H-2K[b]:Ig = 250.000 daltons. R = proporción molar de exceso deseada, p. ej., 160. Mp = microgramos (µg) de péptido de interés. MK[b] = microgramos (µg) de H-2K[b]:Ig en la reacción. Una cantidad típica de H-2K[b]:Ig cargada con péptido para usar en la tinción de citometría de flujo es de 0,25 a 4 µg/millón de células (prueba). Mp = MK[b] x R x Dp = 4 µg x 160 x 1.040 d = 2,66 µg Por lo tanto, se añadirían 2,66 µg de péptido y 4 µg de H-2K[b]:Ig DKb 250.000 d en solución para la carga óptima de péptido de H-2Kb:Ig. 4. Mezcle el péptido y la H-2K[b]:Ig en PBS a pH 7,2 e incube a 37 °C durante la noche. La H-2K[b]:Ig cargada con péptido puede conservarse a 4 °C hasta una semana. Protocolo 2: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Prepare la mezcla de tinción de la proteína H-2K[b] cargada con péptido mezclando 0,25-4 µg de proteína H-2K[b]/prueba con 0,25-4 µg de mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083)/prueba en una proporción de 1:1 o 1:2 de dímero:A85-1. Incube la mezcla durante 60 minutos a temperatura ambiente y protéjala de la luz. 2. Añadir 0,25-4 µg de mAb A111-3 de control de isotipo IgG1 de ratón purificado (n.° de cat. 553485)/prueba a la mezcla de tinción (véase el paso 1 anterior). Incubar la mezcla de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente y proteger de la luz. 3. Resuspender las células de ratón en el tampón de tinción BD FACS™ [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN₃ o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.° de cat. 554656], que contenga la cantidad adecuada de mAb 2.4G2 anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ (n.° de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10 e⁻¹ células por 50 µl. Incubar 10 minutos a 4 °C. Agregue ~1 x10e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™ N.º de cat. 352008). 4. Agregue 50 µl de tampón BD FACS que contenga la cantidad óptima por prueba del cóctel de tinción, más cualquier otro anticuerpo específico del marcador de superficie celular que se usará para cada muestra. 5. Lave las células 2x con 2 ml de tampón BD FACS, centrifugue durante 5 minutos a 250 xg y deseche el sobrenadante. Resuspenda el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo apropiado para el citómetro de flujo. Protocolo 3: Alternativa: Tinción inmunofluorescente Protocolo 1. Resuspenda las células de ratón en tampón de tinción BD FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN3 o tampón de tinción BD Pharmingen (FBS), cat. N.º 554656], que contiene la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado con bloque Fc de ratón BD 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10 e² células por 50 µl. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Añadir aproximadamente 1 x 10 e² células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon n.º de cat. 352008). 2. Añadir de 0,25 a 4 µg de proteína H-2K[b]:Ig cargada con péptido a la suspensión celular. Incubar durante 60 minutos a 4 °C. 3. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón BD FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 µg y aspirar el sobrenadante. 4. Resuspender las células en 100 µl de tampón BD FACS con reactivo secundario fluorescente adecuadamente diluido. Normalmente utilizamos mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.° de cat. 550083). Incubar de 30 a 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón BD FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.