BD, 550946, BD Pharmingen™ Estreptavidina HRP

Aplicación: Inmunohistoquímica (probada rutinariamente)
ID de registro: AB_2868972
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ProClin™ 150 como conservante.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: La estreptavidina se conjugó con la enzima en condiciones óptimas. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Procedimiento de preparación inmunohistoquímica y tinción para secciones congeladas Materiales necesarios: Solución salina tamponada con fosfato (PBS); 2-metilbutano (isopentano); Acetona; Nitrógeno líquido: Hielo seco; Peróxido de hidrógeno (H2O2); Alcoholes graduados; Xileno; Hematoxilina. Moldes de inclusión Peel-A-Way® (Polysciences Inc., Warrington, PA). Compuesto OCT para congelación de tejido e inclusión (Tissue-Tek®; Sakura Finetek USA). I. Fijación, procesamiento y seccionamiento de tejido para secciones congeladas 1. Etiquete el molde de inclusión y llénelo parcialmente con material de congelación e inclusión de tejido. 2. Coloque una muestra de tejido fresco en moldes de inclusión previamente etiquetados. 3. Sumerja el molde de inclusión con el tejido en 2-metilbutano previamente enfriado en un recipiente Dewar con nitrógeno líquido hasta que el bloque CASI se solidifique (30 segundos). NOTA: Si el bloque se deja demasiado tiempo, puede agrietarse. 4. Retire el bloque de tejido del 2-metilbutano usando pinzas largas. 5. Coloque los tejidos bloqueados en hielo seco. (Los tejidos se pueden almacenar en los moldes de inclusión). 6. Almacene los bloques de tejido congelados en un congelador a -70 °C hasta el seccionamiento. 7. Para el seccionamiento, fije el bloque de tejido congelado en la abrazadera del criostato adhiriéndolo con una pequeña cantidad de matriz de tejido congelado y deje que se congele. 8. Las secciones de rutina se cortan a 5 micrones y se recogen en un portaobjetos de vidrio, por ejemplo, portaobjetos para microscopio Superfrost® Plus. 10. Seque durante la noche a temperatura ambiente (TA). 11. Fije las secciones en acetona fría (-20 °C) durante 2 minutos u otro fijador adecuado (por ejemplo, alcohol, alcohol formal, formalina, etc.). 12. Seque completamente los portaobjetos fijados [generalmente 1 hora a temperatura ambiente (TA)]. 13. Almacene en un congelador a -70 °C hasta su uso. II. Procedimiento estándar de tinción inmunohistoquímica para secciones congeladas. Realice todas las incubaciones en una cámara húmeda y no permita que las secciones se sequen. También se deben ejecutar los controles de isotipo y del sistema, que deben coincidir con el isotipo de cada anticuerpo primario que se va a analizar. Lea el procedimiento completo antes de teñir los portaobjetos. 1. Retire del congelador los portaobjetos congelados preparados con antelación y deje que alcancen la temperatura ambiente. 2. Etiquete todos los portaobjetos con un bolígrafo que utilice tinta resistente a disolventes y delimite el tejido si es necesario. 3. Enjuague los portaobjetos 2-3 veces en PBS para eliminar el medio de montaje congelado. 4. Aplique una solución de H₂O₂ al 0,03 % en PBS (~10 min) para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. 5. Enjuague los portaobjetos con un cambio de PBS. 6. Limpie el exceso de tampón alrededor de la muestra. 7. Bloquee con suero normal al 5% diluido en PBS durante 15 min.* 8. Aplique el anticuerpo primario diluido en BD Pharmingen™ Antibody Diluent for IHC (Cat. No. 559148) para cubrir las secciones de tejido en el portaobjetos e incube 1 h a TA en una cámara húmeda. 9. Enjuague los portaobjetos en 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. Opcional: Bloquee la biotina endógena utilizando un tampón de bloqueo de biotina endógena, p. ej., Biotin/Avidin Blocking Kit (Vector Laboratories, Cat. No. SP-2001) si el tejido tiene biotina endógena que puede causar tinción de fondo. 10. Limpie el portaobjetos de nuevo y aplique el anticuerpo secundario biotinilado diluido en BD Pharmingen™ Antibody Diluent for IHC y deje incubar a TA durante 30 min. Este anticuerpo debe coincidir para reconocer la especie y el isotipo del anticuerpo primario. 11. Enjuague los portaobjetos con 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. 12. Limpie de nuevo y aplique Strepavidin HRP usando BD Pharmingen™ Streptavidin HRP (Cat. No. 550946) o una solución comparable disponible comercialmente que contenga Strepavidin HRP a cada portaobjetos e incube a TA 30 min. 13. Enjuague los portaobjetos con 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. 14. Prepare el sustrato usando el BD Pharmingen™ DAB Substrate Kit (Cat. No. 550880) o alternativamente el AEC Substrate con el BD Pharmingen™ AEC Substrate Kit (Cat. No. 551015). 15. Drene el PBS de los portaobjetos, colóquelos sobre una superficie plana y aplique la solución de sustrato asegurándose de que toda la sección esté cubierta por la solución. Deje que los portaobjetos se incuben y verifique el desarrollo del color después de 5 minutos o hasta que se obtenga la intensidad de color deseada. La actividad de HRP genera un producto de color marrón a partir del sustrato DAB, mientras que HRP produce un producto de color rojo a partir del sustrato AEC. NOTA DE SEGURIDAD: Lea atentamente las Declaraciones de peligro y precauciones asociadas para los sustratos y componentes de estos kits antes de usarlos. Se sospecha que el DAB es un carcinógeno y debe manipularse con cuidado. 16. Recoja cada portaobjetos en el orden en que se aplicó el sustrato, escurra el exceso de solución de sustrato en una toalla de papel y colóquelo en una rejilla de tinción en un plato con agua. 17. Enjuague bien los portaobjetos con agua 3 veces. 18. Contrateñir el tejido: a. Sumergir dos veces en hematoxilina. b. Enjuagar bien con agua. 19. Agregue 1 o 2 gotas de medio de montaje disponible en el mercado (p. ej., medio de montaje Aqua-Mount®) sobre el tejido y coloque un cubreobjetos de vidrio sobre el tejido seguido de sellarlo (p. ej., con esmalte de uñas transparente) si lo desea. NOTAS: * Utilice siempre suero de la especie en la que se produce el anticuerpo secundario: es decir, si el anticuerpo secundario es Ig de cabra antirratón, entonces bloquee con suero de cabra normal al 5%. Incube durante 10-30 minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. No enjuague después de este paso (golpee la solución de bloqueo si utiliza cámaras húmedas) y vaya directamente a la aplicación del anticuerpo primario. Es importante no utilizar azida sódica en ninguno de los tampones cuando se utiliza peroxidasa de rábano picante, ya que la azida inactiva la enzima. Preparación inmunohistoquímica y procedimiento de tinción para secciones incluidas en parafina Materiales necesarios: solución salina tamponada con fosfato (PBS); disponible comercialmente: formalina tamponada neutra al 10% para IHC; peróxido de hidrógeno (H2O2); alcoholes graduados; xileno; hematoxilina. I. Fijación y procesamiento de tejido para secciones de parafina. Lea todo el procedimiento antes de teñir los portaobjetos. A. Fijación de tejidos en formalina tamponada neutra al 10 % 1. Los tejidos que se van a fijar y procesar deben cortarse a un tamaño no mayor de 3 mm de grosor. Deje que los tejidos se fijen en formalina tamponada neutra al 10 % a temperatura ambiente durante 8 horas, pero sin exceder las 24 horas. 2. Siga el programa de procesamiento recomendado en la sección CB Fijación alternativa de tejidos en fijadores de zinc: 1. Muchos epítopos antigénicos se enmascaran o incluso se destruyen con la fijación con formalina al 10 %. En algunos casos, la fijación en un fijador más suave, como el fijador de zinc BD Pharmingen™ IHC (n.º de cat. 550523) o el fijador de zinc BD Pharmingen™ 10X (sin formalina) [n.º de cat. 552658], es útil para preservar los epítopos antigénicos. Coloque tejidos frescos recortados a 3 mm de grosor en el fijador y deje que los tejidos se fijen durante 24-48 horas a temperatura ambiente. 2. Siga el programa de procesamiento recomendado en la sección CC Programa de procesamiento: Nota: El procesamiento, inclusión y seccionamiento de bloques de parafina requiere equipo y experiencia altamente especializados y generalmente lo realiza un laboratorio de histología o patología. Si bien el procesamiento manual se puede realizar de acuerdo con el siguiente protocolo, los resultados pueden mostrar una variación marcada en la calidad histológica y la antigenicidad. Estación Tiempo Solución 1 Retraso Tratar tejido con fijador 2 45 min Alcohol al 70 % 3 45 min Alcohol al 80 % 4 45 min Alcohol al 95 % 5 45 min Alcohol al 100 % 6 60 min Alcohol al 100 % 7 60 min Alcohol al 100 % 8 60 min Reactivo clarificante (xileno o sustituto) 9 60 min Reactivo clarificante (xileno o sustituto) 10 60 min Parafina 1 11 60 min Parafina 2 12 60 min Parafina 3 II. Preparación de portaobjetos con secciones de parafina para inmunohistoquímica A. Seccionamiento y preparación de portaobjetos. 1. Seccione los bloques de parafina al grosor deseado (normalmente 4-5 μm) en un micrótomo y hágalos flotar en un baño de agua que contenga agua desionizada o destilada. 2. Las secciones se recogen en un portaobjetos de vidrio, p. ej., portaobjetos para microscopio Superfrost® Plus. B. Desparafinización y rehidratación de portaobjetos de tejido: 1. Antes de la desparafinización, coloque los portaobjetos en un horno a 55 °C durante 10 min para fundir la parafina. Desparafine los portaobjetos en 2 cambios de xileno o sustituto de xileno durante 5 min cada uno. 2. Transfiera los portaobjetos a alcohol al 100 %, 2 cambios de 3 min cada uno y transfiéralos una vez a través de alcohol al 95 % durante 3 min. 3. Bloquee la actividad de la peroxidasa endógena incubando las secciones en una solución de H2O2 al 3 % en metanol durante 10 min. 4. Enjuague con PBS 2 veces durante 5 minutos cada vez. Opcional: Si el antígeno de interés se altera durante el proceso de fijación, se puede aplicar un método de recuperación de antígeno. Para la recuperación de antígeno y el descubrimiento del epítopo antigénico, utilice los reactivos y protocolos detallados en BD Pharmingen™ Retrievagen A (pH 6,0) [N.º de cat. 550524] o BD Pharmingen™ BD Retrievagen B (pH 9,5) [N.º de cat. 550527]. 5. Bloquee con suero normal al 5 %. 6. Diluya el anticuerpo primario en diluyente de anticuerpos para IHC (N.º de cat. 559148) para cubrir las secciones de tejido en el portaobjetos e incube a 4 °C durante la noche en una cámara húmeda. 7. Al día siguiente, retire los portaobjetos del refrigerador (4 °C) y comience con el paso 9 del procedimiento estándar de tinción inmunohistoquímica. Nota: Es importante no usar azida sódica en ninguno de los tampones cuando se usa peroxidasa de rábano picante, ya que la azida inactiva la enzima. Advertencia: La estreptavidina HRP contiene 0,004 % (p/p) de una mezcla de CMIT/MIT (3:1), que es una mezcla de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 247-500-7] y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 220-239-6] (3:1). Indicaciones de peligro Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Consejos de precaución Llevar guantes y protección ocular. Llevar ropa protectora. Evitar respirar la niebla/los vapores/el aerosol. Si se produce irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las normativas locales/regionales/nacionales/internacionales.
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Ingrediente peligroso: ProClin™ 150. Evite la exposición a la piel y los ojos, así como su ingestión. Lave la piel expuesta con agua y jabón. Enjuague los ojos con agua. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company. Para conocer las patentes estadounidenses aplicables, consulte bd.com/patents.