BD, 551008, BD Pharmingen™ AKP Estreptavidina

Aplicación: Inmunohistoquímica (probada rutinariamente)
ID de registro: AB_10051240
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: La estreptavidina se conjugó con la enzima en condiciones óptimas. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Procedimiento de preparación inmunohistoquímica y tinción para secciones congeladas Materiales necesarios: Solución salina tamponada con fosfato (PBS); 2-metilbutano (isopentano); Acetona; Nitrógeno líquido; Hielo seco; Peróxido de hidrógeno (H2O2); Alcoholes graduados; Moldes de inclusión de xileno Peel-A-Way® (Polysciences Inc., Warrington, PA). Compuesto OCT para congelación de tejido e inclusión (Tissue-Tek®; Sakura Finetek USA). Sistema de sustrato líquido BCIP®/NBT (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/p-yodonitrotetrazolio) (Sigma-Aldrich). I. Fijación, procesamiento y seccionamiento de tejido para secciones congeladas 1. Etiquete el molde de inclusión y llénelo parcialmente con compuesto OCT. 2. Coloque una muestra de tejido fresco en moldes de inclusión previamente etiquetados. 3. Sumerja el molde de inclusión con el tejido en 2-metilbutano preenfriado en un dewar con nitrógeno líquido hasta que el bloque CASI se solidifique (30 segundos). NOTA: Si el bloque se deja demasiado tiempo, puede agrietarse. 4. Retire el bloque de tejido del 2-metilbutano con unas pinzas largas. 5. Coloque los tejidos bloqueados en hielo seco. (Los tejidos se pueden almacenar en los moldes de inclusión). 6. Guarde los bloques de tejido congelados en un congelador a -70 °C hasta el seccionamiento. 7. Para el seccionamiento, fije el bloque de tejido congelado en el plato del criostato adhiriéndolo con una pequeña cantidad de matriz de tejido congelado y deje que se congele. 8. Las secciones de rutina se cortan a 5 micras y se recogen en un portaobjetos de vidrio, por ejemplo, portaobjetos de microscopio Superfrost® Plus. 10. Seque durante la noche a temperatura ambiente (TA). 11. Fije las secciones en acetona fría (-20 °C) durante 2 minutos u otro fijador adecuado (por ejemplo, alcohol, alcohol formal, formalina, etc.). 12. Seque completamente los portaobjetos fijados [normalmente 1 hora a temperatura ambiente (TA)]. 13. Guárdelos en un congelador a -70 °C hasta su uso. II. Procedimiento estándar de tinción inmunohistoquímica para secciones congeladas Realice todas las incubaciones en una cámara húmeda y no permita que las secciones se sequen. También se deben ejecutar los controles de isotipo y sistema, que deben coincidir con el isotipo de cada anticuerpo primario que se va a analizar. Materiales necesarios: Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Sistema de sustrato líquido BCIP®/NBT (Sigma-Aldrich) Lea todo el procedimiento antes de teñir los portaobjetos. 1. Retire del congelador los portaobjetos congelados preparados con antelación y deje que alcancen la TA. 2. Etiquete todos los portaobjetos con un bolígrafo que utilice tinta resistente a disolventes y delimite el tejido si es necesario. 3. Enjuague los portaobjetos 2-3 veces en PBS para eliminar el medio de montaje congelado. 4. Aplique una solución de H2O2 al 0,03 % en PBS (~10 min) para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. 5. Enjuague los portaobjetos con un cambio de PBS. 6. Limpie el exceso de tampón alrededor de la muestra. 7. Bloquee con suero normal al 5% diluido en PBS durante 15 min.* 8. Aplique el anticuerpo primario diluido en BD Pharmingen™ Antibody Diluent for IHC (Cat. No. 559148) para cubrir las secciones de tejido en el portaobjetos e incube 1 h a TA en una cámara húmeda. 9. Enjuague los portaobjetos en 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. Opcional: Bloquee la biotina endógena utilizando un tampón de bloqueo de biotina endógena, por ejemplo, Biotin/Avidin Blocking Kit (Vector Laboratories, Cat. No. SP-2001) si el tejido tiene biotina endógena que puede causar tinción de fondo. 10. Limpie el portaobjetos de nuevo y aplique el anticuerpo secundario biotinilado diluido en BD Pharmingen™ Antibody Diluent for IHC y deje incubar a TA durante 30 min. Este anticuerpo debe coincidir para reconocer la especie y el isotipo del anticuerpo primario. 11. Enjuague los portaobjetos en 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. 12. Limpie de nuevo y aplique AKP Streptavidin usando BD Pharmingen™ AKP Streptavidin (Cat. No. 551008) a cada portaobjetos e incube a TA 30 min. 13. Enjuague los portaobjetos en 3 cambios de PBS, 2 min cada uno. 14. Prepare BCIP/NBT como sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina. BCIP/NBT es un cromógeno ampliamente utilizado para tinción inmunohistoquímica, p. ej., BCIP®/NBT Liquid Substrate System (Sigma-Aldrich). 15. Drene el PBS de los portaobjetos, colóquelos sobre una superficie plana y aplique la solución de sustrato BCIP/NBT asegurándose de que toda la sección esté cubierta por la solución. Deje que los portaobjetos se incuben y verifique el desarrollo del color después de 5 minutos o hasta que se obtenga la intensidad de color deseada. AKP actúa sobre BCIP/NBT para generar un producto final de diformazán NBT insoluble que es de color azul a púrpura. Este producto final es soluble en alcohol y, por lo tanto, se debe usar con una contratinción acuosa y medios de montaje. 16. Enjuague bien los portaobjetos en agua 3 veces. 17. Contratine los tejidos como desee. 18. Agregue 1-2 gotas de un medio de montaje disponible en el mercado (por ejemplo, Aqua-Mount® Mounting Medium) en el tejido y coloque un cubreobjetos de vidrio sobre el tejido seguido de sellado (por ejemplo, con esmalte de uñas transparente) si lo desea. NOTAS: * Siempre use suero de la especie en la que se produce el anticuerpo secundario: es decir, si el anticuerpo secundario es Ig anti-ratón de cabra, entonces bloquee con suero de cabra normal al 5%. Incube durante 10-30 minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. No enjuague después de este paso (golpee suavemente la solución de bloqueo si usa cámaras húmedas) y vaya directamente a la aplicación del anticuerpo primario. Preparación inmunohistoquímica y procedimiento de tinción para secciones incluidas en parafina Materiales necesarios: Solución salina tamponada con fosfato (PBS); Disponible comercialmente: Formalina tamponada neutra al 10% para IHC; Peróxido de hidrógeno (H2O2); Alcoholes graduados; Xileno; Hematoxilina. I. Fijación y procesamiento de tejido para secciones de parafina. Lea todo el procedimiento antes de teñir los portaobjetos. A. Fijación de tejidos en formalina tamponada neutra al 10% 1. Los tejidos que se fijarán y procesarán deben cortarse a un tamaño no mayor de 3 mm de espesor. Deje que los tejidos se fijen en formalina tamponada neutra al 10% disponible comercialmente a temperatura ambiente durante 8 horas, pero sin exceder las 24 horas. 2. Siga el programa de procesamiento recomendado en la sección CB Fijación alternativa de tejidos en fijadores de zinc: 1. Muchos epítopos antigénicos se enmascaran o incluso se destruyen con la fijación con formalina al 10%. En algunos casos, la fijación en un fijador más suave, como BD Pharmingen™ IHC Zinc Fixative (Cat. No. 550523) o BD Pharmingen™ 10X Zinc Fixative (Formalin Free) [Cat. No. 552658], es útil para preservar los epítopos antigénicos. Coloque tejidos frescos recortados a 3 mm de grosor en el fijador y deje que los tejidos se fijen durante 24-48 horas a temperatura ambiente. 2. Siga el programa de procesamiento recomendado en la sección CC Programa de procesamiento: Nota: El procesamiento, la inclusión y el seccionamiento de bloques de parafina requieren equipo y experiencia altamente especializados y generalmente lo realiza un laboratorio de histología o patología. Si bien el procesamiento manual se puede realizar de acuerdo con el siguiente protocolo, los resultados pueden mostrar una variación marcada en la calidad histológica y la antigenicidad. Estación Tiempo Solución 1 Retraso Tratar el tejido con fijador 2 45 min Alcohol al 70 % 3 45 min Alcohol al 80 % 4 45 min Alcohol al 95 % 5 45 min Alcohol al 100 % 6 60 min Alcohol al 100 % 7 60 min Alcohol al 100 % 8 60 min Reactivo clarificante (xileno o sustituto) 9 60 min Reactivo clarificante (xileno o sustituto) 10 60 min Parafina 1 11 60 min Parafina 2 12 60 min Parafina 3 II. Preparación de portaobjetos con secciones de parafina para inmunohistoquímica A. Seccionamiento y preparación de portaobjetos. 1. Seccione los bloques de parafina al grosor deseado (normalmente 4-5 μm) en un micrótomo y flote en un baño de agua que contenga agua desionizada o destilada. 2. Las secciones se recogen en un portaobjetos de vidrio, p. ej., portaobjetos para microscopio Superfrost® Plus. B. Desparafinización y rehidratación de portaobjetos de tejido: 1. Antes de la desparafinización, coloque los portaobjetos en un horno a 55 °C durante 10 minutos para fundir la parafina. Desparafine los portaobjetos en 2 cambios de xileno o sustituto de xileno durante 5 minutos cada uno. 2. Transfiera los portaobjetos a alcohol al 100 %, 2 cambios de 3 minutos cada uno y transfiéralos una vez a través de alcohol al 95 % durante 3 minutos. 3. Bloquee la actividad de la peroxidasa endógena incubando las secciones en una solución de H₂O₂ al 3 % en metanol durante 10 minutos. 4. Enjuague en PBS 2 veces durante 5 minutos cada vez. Opcional: Si el antígeno de interés se altera durante el proceso de fijación, se puede aplicar un método de recuperación de antígeno. Para la recuperación de antígenos para desenmascarar el epítopo antigénico, utilice los reactivos y protocolos detallados en BD Pharmingen™ Retrievagen A (pH 6,0) [Cat. No. 550524] o BD Pharmingen™ BD Retrievagen B (pH 9,5) [Cat. No. 550527]. 5. Bloquee con suero normal al 5%. 6. Diluya el anticuerpo primario en diluyente de anticuerpos para IHC (Cat. No. 559148) para cubrir las secciones de tejido en el portaobjetos e incube a 4 °C durante la noche en una cámara húmeda. 7. Al día siguiente, retire los portaobjetos del refrigerador (4 °C) y comience con el paso 9 del procedimiento de tinción inmunohistoquímica estándar. Observe el color de la tinción del anticuerpo en las secciones de tejido bajo microscopio.
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Para conocer las patentes estadounidenses aplicables, consulte bd.com/patents.