BD, 551263, BD™ DimerX DimerX I: proteína de fusión dimérica soluble recombinante HLA-A2:Ig humana

Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. La proteína HLA-A2 se expresó junto con la β2M humana en la línea celular de plasmocitoma de ratón J558L (ATCC TIB-6). Las cadenas polipeptídicas HLA-A2 y β2M se asocian de forma no covalente como consecuencia de su coexpresión en las células J558L. La proteína de fusión HLA-A2:Ig se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular mediante cromatografía de afinidad. La pureza de la preparación se confirmó mediante SDS-PAGE.
Procedimientos de ensayo recomendados: Esta proteína de fusión HLA-A2:Ig se ha analizado mediante tinción inmunofluorescente (≤ 2 µg HLA-A2:Ig/millón de células) (véase la figura) y análisis por citometría de flujo de linfocitos T específicos de antígeno para garantizar su especificidad y reactividad. Es necesario cargar las porciones HLA-A2 de la proteína dimérica con un péptido de interés relevante antes de la tinción inmunofluorescente de los linfocitos T. Los complejos HLA-A2:Ig se cargan eficazmente mediante la incubación con un exceso de péptidos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (véase el protocolo 1). Se puede utilizar HLA-A2:Ig cargado con péptidos para la tinción inmunofluorescente (véase el protocolo 2). El mAb BB7.2 conjugado con FITC (anti-HLA-A2 humano, Cat. No. 551285) es útil para determinar el fenotipo A2 de las células antes de la tinción con la proteína de fusión HLA-A2:Ig. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de péptidos de la proteína dimérica HLA-A2:Ig Se han descrito varios protocolos de carga de péptidos. El método utilizado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva del exceso de péptido en solución con la proteína HLA-A2:Ig. Hemos descubierto que la carga pasiva funciona particularmente bien en el caso de péptidos de alta afinidad. Para péptidos de menor afinidad, un aumento en la relación molar de péptido a HLA-A2:Ig puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo. Se sugiere que para cada péptido, el investigador determine empíricamente parámetros como la dosis de HLA-A2:Ig por millón de células, la relación molar del péptido con HLA-A2:Ig y el tiempo de carga del péptido. Los parámetros y los requisitos mínimos para la unión del péptido a HLA-A2 se han reportado en la literatura. Si bien este producto DimerX contiene β2 microglobulina, para los investigadores que requieren un exceso de β2 microglobulina humana recombinante, recomendamos BD Biosciences Cat. No. 551089. Preparación y carga del péptido: 1. Será necesario determinar el peso molecular (PM) de un péptido de interés. El PM de un péptido se puede estimar multiplicando su número (n) de aminoácidos (AA) por 130 daltons (d) por aminoácido: PM del péptido (d) = n (AA) x 130 (d/AA) 2. Se puede preparar un stock de péptido a 20 mg/ml en DMSO. Diluir la solución peptídica a 2 mg/ml en DPBS estéril, pH 7,2 para su uso en el protocolo de carga de HLA-A2:Ig. 3. Mezclar la proteína HLA-A2:Ig con el péptido específico o de control en un exceso molar (M) de 40, 160 o 640. Se puede utilizar el siguiente cálculo, utilizando un péptido de 8 aminoácidos (8mer) como ejemplo: Dp = Peso molecular del péptido: p. ej., 8 aminoácidos x 130 = 1040 daltons. DA = Peso molecular de HLA-A2:Ig = 250 000 daltons. R = relación molar de exceso deseada, p. ej., 160. Mp = microgramos (µg) del péptido de interés. MA = microgramos (µg) de HLA-A2:Ig en la reacción. Una cantidad típica de HLA-A2:Ig con péptido para tinción de citometría de flujo es de 1 a 2 µg/millón de células (prueba). Mp = MA x R x Dp = 4 µg x 160 x 1040 d = 2,66 µg DA 250 000 d. Por lo tanto, se añadirían 2,66 µg de péptido y 4 µg de HLA-A2:Ig en solución para una carga óptima de péptidos. 4. Mezclar el péptido y la HLA-A2:Ig en PBS a pH 7,2 e incubar a 37 °C durante la noche. La HLA-A2:Ig con péptidos se puede conservar a 4 °C hasta una semana. Protocolo 2: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Resuspender las PBMC o células diana en tampón de tinción FACS [p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen™ con BSA, n.º de cat. 554657], a una concentración aproximada de 10 e6 células por 50 µl. Añadir ~1 x 10 e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™, n.º de cat. 352008). 2. Preparar la mezcla de tinción de la proteína HLA-A2 cargada con péptidos mezclando 1-2 µg de proteína HLA-A2 cargada con péptidos/prueba con 1-2 µg de mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083)/prueba en una proporción de 1:1 o 1:2 de dímero: mAb A85-1. Incubar la mezcla durante 60 minutos a temperatura ambiente y proteger de la luz. 3. Añadir 1-2 µg de mAb A111-3 de control de isotipo IgG1 de ratón purificado (n.º de cat. 553485)/prueba al cóctel de tinción (véase el paso 2 anterior). Incubar el cóctel de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente y proteger de la luz. 4. Preparar IgG humana policlonal purificada a aproximadamente 0,2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. 5. Añadir 10 µl (2 µg) de stock de IgG humana por tubo para bloquear la unión no específica de DimerX I o reactivos de anticuerpos a los receptores Fc de superficie. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Añadir 50 µl de tampón FACS que contenga la cantidad óptima por prueba del cóctel de tinción, más cualquier otro anticuerpo específico para marcadores de superficie celular que se vaya a utilizar en cada muestra. 7. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y aspirar el sobrenadante. Resuspender en tampón FACS y analizar mediante citometría de flujo.* *Dentro de una población celular, la frecuencia de células capaces de reconocer complejos péptido-MHC específicos suele ser muy baja, p. ej., <1 %. Recomendamos la adquisición de al menos 100 000 linfocitos para el análisis por citometría de flujo para una detección óptima de esta subpoblación. Protocolo 3: Alternativa: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Resuspender las PBMC o las células diana en tampón de tinción FACS [p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen™ con BSA, n.º de cat. 554657], a una concentración aproximada de 10 e² células por 50 µl. Añadir ~1x 10e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™ Cat. No. 352008). 2. Preparar IgG humana policlonal purificada a aproximadamente 0,2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. 3. Añadir 10 µl (2 µg) de stock de IgG humana por tubo para bloquear la unión no específica de DimerX I o reactivos de anticuerpos a los receptores Fc de superficie. Incubar 10 minutos a TA. 4. Añadir de 1 a 2 µg de proteína HLA-A2:Ig cargada con péptido a cada muestra. Incubar 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células 1x con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y aspirar el sobrenadante. 6. Nuevamente agregue 10 µl (2 µg) de IgG humana policlonal purificada por muestra. Incube 10 minutos a TA. 7. Agregue 100 µl de tampón FACS que contenga reactivo secundario fluorescente diluido adecuadamente. Normalmente usamos mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, Cat. No. 550083). Incubar 30 minutos a TA.** 8. Lave las células 1x con 2 ml de tampón FACS, centrifugue durante 5 minutos a 250 xg y aspire el sobrenadante. Resuspenda en tampón FACS y analice por citometría de flujo.*** **En este paso se pueden incluir anticuerpos adicionales específicos para marcadores como CD4, CD8 o HLA-A2 agregando anticuerpos conjugados con fluorescencia diluidos adecuadamente. NOTA: BD™ Dimerx HLA-A2:Ig es una proteína de fusión que contiene regiones de cadena pesada de IgG1 de ratón. Por lo tanto, es importante elegir reactivos de un isotipo diferente para evitar la posible tinción del reactivo secundario (anti-IgG1) con estos otros anticuerpos. ***Dentro de una población celular, la frecuencia de células capaces de reconocer complejos péptido-MHC específicos suele ser muy baja, p. ej., <1 %. Recomendamos la adquisición de al menos 100 000 linfocitos para el análisis de citometría de flujo a fin de lograr una detección óptima de esta subpoblación.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.