BD, 551323, BD™ DimerX DimerX I: H-2D[b]:Ig de ratón dímero soluble recombinante

Isotipo: IgG1 de ratón, λ
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2868932
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Conservar sin diluir a 4°C.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Esta proteína de fusión H-2D[b]:Ig se ha probado mediante tinción inmunofluorescente (≤ 4 µg H-2D[b]:Ig/millón de células) (ver Figura 2) y análisis de citometría de flujo de células T específicas de antígeno para asegurar la especificidad y reactividad. Es necesario cargar las porciones H-2D[b] de la proteína dimérica con un péptido relevante de interés antes de la tinción inmunofluorescente de las células T. Los complejos H-2D[b]:Ig se cargan eficazmente mediante incubación con exceso de péptidos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (ver Protocolo 1). H-2D[b]:Ig cargado con péptidos puede usarse para tinción inmunofluorescente (ver Protocolo 2). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de péptidos de la proteína dimérica H-2D[b]:Ig Se han descrito varios protocolos de carga de péptidos. El método empleado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva del exceso de péptido en solución con la proteína H-2D[b]:Ig. Hemos observado que la carga pasiva funciona especialmente bien en el caso de péptidos de alta afinidad. Para péptidos de menor afinidad, un aumento en la relación molar de péptido a H-2D[b]:Ig puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo. Se sugiere que, para cada péptido, el investigador determine empíricamente parámetros como la dosis de H-2D[b]:Ig por millón de células, la relación molar de péptido a H-2D[b]:Ig y el tiempo de carga del péptido. Se han descrito parámetros para la unión del péptido a H-2D[b], incluyendo los péptidos que se utilizan rutinariamente en BD Biosciences Pharmingen para la evaluación de H-2D[b]:Ig. Si bien este producto DimerX contiene β2 microglobulina, para los investigadores que requieren un exceso de β2 microglobulina humana recombinante, recomendamos el n.º de cat. de BD Biosciences. 551089. Preparación y carga de péptidos: 1. Se debe determinar el peso molecular (PM) del péptido de interés. El PM de un péptido se puede estimar multiplicando su número (n) de aminoácidos (AA) por 130 daltons (d) por aminoácido: PM del péptido (d) = n (AA) x 130 (d/AA). 2. Se puede preparar una solución madre de péptido a 20 mg/ml en DMSO. Diluya la solución de péptido a 2 mg/ml en DPBS estéril, pH 7,2, para su uso en el protocolo de carga de H-2D[b]:Ig. 3. Mezcle la proteína H-2D[b]:Ig con el péptido específico o de control con un exceso molar (M) de 40, 160 o 640. Se puede realizar el siguiente cálculo, utilizando un péptido de 8 aminoácidos (8mer) como ejemplo: Dp = Peso molecular del péptido: p. ej., 8 aminoácidos x 130 = 1040 daltons. DDb = Peso molecular de H-2Db:Ig = 250 000 daltons. R = Relación molar de exceso deseada, p. ej., 160. Mp = microgramos (µg) del péptido de interés. MDb = microgramos (µg) de H-2Db:Ig en la reacción. Una cantidad típica de H-2Db:Ig con péptido para la tinción por citometría de flujo es de 0,25 a 4 µg/millón de células (prueba). Mp = MDb x R x Dp ÷ DDb = 4 µg x 160 x 1040 d ÷ 250 000 d = 2,66 µg. Por lo tanto, se añadirían 2,66 µg de péptido y 4 µg de H-2D[b]:Ig en solución para una carga óptima de péptidos. Mezclar el péptido y la H-2D[b]:Ig en PBS a pH 7,2 e incubar a 37 °C durante la noche. La H-2D[b]:Ig con el péptido se puede conservar a 4 °C hasta una semana. Protocolo 2: Tinción Inmunofluorescente. Protocolo 1. Prepare la mezcla de tinción de la proteína H-2D[b] cargada con péptidos mezclando 0,25-4 µg de proteína H-2D[b] cargada con péptidos/prueba con 0,25-4 µg de mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083)/prueba en una proporción de 1:1 o 1:2 de dímero:A85-1. Incube la mezcla durante 60 minutos a temperatura ambiente y protéjala de la luz. 2. Añada 0,25-4 µg de mAb A111-3 (n.º de cat. 553485)/prueba, control de isotipo de IgG1 de ratón purificado, a la mezcla de tinción (véase el paso 1 anterior). Incube la mezcla de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente y protéjala de la luz. 3. Resuspender las células de ratón en el tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN₃ o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.º de cat. 554656], que contenga la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10^6 células por 50 µl. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Añadir ~1 × 10^6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™, n.º de cat. 352008). 4. Añadir 50 µl de tampón FACS con la cantidad óptima por prueba del cóctel de tinción a cada muestra, además de cualquier otro anticuerpo específico para marcadores de superficie celular que se vaya a utilizar. Incubar 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 × g y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo. Protocolo 3: Alternativa: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Resuspender las células de ratón en tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN₃ o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.º de cat.]. 554656], que contiene la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10^6 células por 50 µl. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Añadir ~1 × 10^6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™ n.º de cat. 352008). 2. Añadir de 0,25 a 4 µg de proteína H-2D[b]:Ig cargada con péptido a la suspensión celular. Incubar durante 60 minutos a 4 °C. 3. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 × g y aspirar el sobrenadante. 4. Resuspender las células en 100 µl de tampón FACS con reactivo secundario fluorescente adecuadamente diluido. Normalmente utilizamos mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083). Incubar de 30 a 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 × g y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.