BD, 552576, Conjunto ELISA de IgG2a de ratón BD OptEIA™

Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2868964
Descripción: Descripción El set OptEIA™ para IgG2a de ratón contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para IgG2a de ratón natural o purificada en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización de ensayos Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales de laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo).
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5 con NaOH 10 N. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato BD Pharmingen™ TMB (n.º de cat. 555214). 5. Solución de parada: H3PO4 1 M o H2SO4 2 N Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta de un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado por centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y deje que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: Recoja el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Mezcle suavemente con vórtex. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, alícuota inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 μl por vial y congélela a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 200 ng/mL a partir de la solución madre del estándar. Mezcle con vórtex. (Consulte las instrucciones de dilución en el Certificado de instrucciones/análisis). b. Añada 300 μL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquetar como 100 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,3 ng/mL y 3,1 ng/mL. c. Realizar diluciones seriadas añadiendo 300 μL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Estandarización: Este inmunoensayo está calibrado contra IgG2a de ratón purificada. Procedimiento detallado del ensayo 1. Recubrir los micropocillos con 100 μL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Sellar la placa e incubar durante la noche a 4 °C. 2. Aspirar los pocillos y lavar 3 veces con ≥ 300 μL/pocillo de tampón de lavado. Tras el último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 μL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a TA durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 μL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Selle la placa e incube durante 2 horas a TA. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 8. Añada 100 μL de anticuerpo de detección diluido en diluyente de ensayo a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a TA. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 10. Agregue 100 μL de reactivo enzimático diluido en diluyente de ensayo a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 30 min a temperatura ambiente. 11. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este paso de lavado final, sumerja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto para cada lavado. 12. Agregue 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 13. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo. 14. Lea la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 minutos de detener la reacción. Si está disponible la corrección de longitud de onda, reste la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Agregue 100 μL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspirar y lavar 3 veces. 3. Bloquear las placas: 200 μL de diluyente de ensayo en cada pocillo. Incubar 1 h a temperatura ambiente. 4. Aspirar y lavar 3 veces. 5. Añadir 100 μL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 h a temperatura ambiente. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Añadir 100 μL de Ab de detección diluido a cada pocillo. Incubar 1 h a temperatura ambiente. 8. Aspirar y lavar 5 veces. 9. Añadir 100 μL de SAv-HRP diluido a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente. 10. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min). 11. Añadir 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. 12. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Lea a 450 nm dentro de 30 min con corrección λ 570 nm. Cálculo de resultados Calcule la absorbancia media para cada conjunto de estándares duplicados, controles y muestras. Reste la absorbancia estándar cero media de cada uno. Dibuje la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de IgG2a en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibuje la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de IgG2a de las incógnitas, encuentre el valor de absorbancia media de la incógnita en el eje y y dibuje una línea horizontal hacia la curva estándar. En el punto de intersección, dibuje una línea vertical hacia el eje x y lea la concentración de IgG2a. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de IgG2a por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos por computadora, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Las siguientes inmunoglobulinas se analizaron a ≥ 10 µg/ml para detectar posible reactividad cruzada en el kit ELISA de IgG2a de ratón BD OptEIA™. No se identificaron reactividades cruzadas significativas (valores ≥ 3,1 ng/ml). Inmunoglobulinas de ratón: IgG1 (κ), IgG1 (λ), IgG2b (κ), IgG2b (λ), IgG3 (κ), IgG3 (λ), IgM (κ), IgM (λ), IgA (κ), IgA (λ), IgE (κ) Inmunoglobulinas de rata: IgG1 (κ), IgG1 (λ), En este ensayo se analizaron muestras de suero de diferentes especies de ratones (BALB/c, NZB, NZBWF1 y BXSB), inmunizados o no inmunizados. Las concentraciones de IgG2a medidas variaron de 0,16 mg/ml a 5,46 mg/ml. No se encontró IgG2a detectable en el suero de ratón SCID (RAG-/-). Alotipos de inmunoglobulina Los investigadores deben tener en cuenta que pueden ocurrir ligeras diferencias con las mediciones de los niveles de IgG2a entre diferentes especies y/o alotipos. Se sabe que el conjunto de IgG2a de ratón BD OptEIA™ tiene diferentes afinidades para IgG2a de ratones del alotipo b en comparación con el alotipo a. Reconoce un alotipo IgG2a aproximadamente 8,1 veces mejor que el alotipo b IgG2a. Debido a que se utiliza un anticuerpo monoclonal IgG2a purificado del alotipo a para el estándar en este ensayo, se debe utilizar un factor de conversión de 8,1 para cuantificar los niveles de IgG2a del alotipo b. Por ejemplo, un grupo de muestras de suero de ratón C57BL/6 (alotipo b) se analizó con este ensayo y mostró un rango de concentración de 1,04-7,84 µg/ml; el rango real debería ser de 8,4-63,5 µg/ml tras la conversión. Limitaciones del procedimiento: · Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. · No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede descartar la posibilidad de interferencia. · Los sets BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del set. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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