BD, 552944, BD™ DimerX DimerX I: proteína de fusión de ratón dimérica soluble PE H-2Kb:Ig

Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. La proteína dimérica H-2Kb:Ig se expresó junto con β2M humana en la línea celular de plasmocitoma de ratón, J558L (ATCC TIB-6). Las cadenas polipeptídicas H-2Kb y β2M están asociadas de forma no covalente como consecuencia de su coexpresión en las células J558L. La proteína de fusión H-2Kb:Ig se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular mediante cromatografía de afinidad. La proteína se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron la proteína no conjugada y el PE libre.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Esta proteína de fusión H-2Kb:Ig se ha probado mediante tinción inmunofluorescente (≤ 4 µg H-2Kb:Ig/millón de células) y análisis de citometría de flujo de células T específicas de antígeno para asegurar la especificidad y reactividad. Es necesario cargar las porciones H-2Kb de la proteína dimérica con un péptido relevante de interés antes de la tinción inmunofluorescente de las células T. Los complejos H-2Kb:Ig se cargan eficazmente mediante incubación con exceso de péptidos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (ver Protocolo 1). H-2Kb:Ig cargado con péptidos puede usarse para tinción inmunofluorescente (ver Protocolo 2). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de péptidos de la proteína dimérica H-2Kb:Ig Un clon de célula T alorreactiva, 2C, es específico para un péptido endógeno, p2Ca. Se han identificado varios péptidos relacionados o análogos peptídicos. Estos difieren en su restricción MHC y en su afinidad por el TCR 2C. Para H-2Kb, el péptido SIY también puede ser reconocido por el TCR 2C en el contexto de H-2Kb. SIY tiene una afinidad relativamente alta por H-2Kb y se sugiere como un control positivo para la tinción de células 2C en este ensayo. El clon 2C se obtuvo originalmente mediante la estimulación de células de bazo BALB/c con células P815 (H-2Ld) irradiadas. Se han descrito varios protocolos de carga de péptidos. El método utilizado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva del exceso de péptido en solución con la proteína H-2Kb:Ig. Hemos observado que la carga pasiva funciona particularmente bien en el caso de péptidos de alta afinidad. Para péptidos de menor afinidad, un aumento en la relación molar de péptido a H-2Kb:Ig puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo. Se sugiere que para cada péptido, el investigador determine empíricamente parámetros como la dosis de H-2Kb:Ig por millón de células, la relación molar del péptido con H-2Kb:Ig y el tiempo de carga del péptido. Si bien este producto DimerX contiene β2 Microglobulina, para los investigadores que requieran un exceso de β2 Microglobulina Humana recombinante, recomendamos BD Biosciences Cat. No. 551089. Preparación y carga del péptido: 1. Será necesario determinar el peso molecular (PM) del péptido de interés. El PM de un péptido se puede estimar multiplicando su número (n) de aminoácidos (AA) por 130 daltons (d) por aminoácido: PM del péptido (d) = n (AA) x 130 (d/AA) 2. Se puede preparar una reserva de péptido a 20 mg/ml en DMSO. Diluir la solución peptídica a 2 mg/ml en DPBS estéril, pH 7,2 para su uso en el protocolo de carga de H-2Kb:Ig. 3. Mezclar la proteína H-2Kb:Ig con el péptido específico o de control en un exceso molar (M) de 40, 160 o 640. Se puede utilizar el siguiente cálculo, utilizando un péptido de 8 aminoácidos (8mer) como ejemplo: Dp = Peso molecular del péptido: p. ej., 8 aminoácidos x 130 = 1040 daltons. DKb = Peso molecular de H-2Kb:Ig = 250 000 daltons. R = relación molar de exceso deseada, p. ej., 160. Mp = microgramos (µg) del péptido de interés. MKb = microgramos (µg) de H-2Kb:Ig en la reacción. Una cantidad típica de H-2Kb:Ig con péptido para tinción de citometría de flujo es de 0,25 a 4 µg/millón de células (prueba). Mp = MKb x R x Dp = 4 µg x 160 x 1040 d = 2,66 µg DKb 250 000 d. Por lo tanto, se añadirían 2,66 µg de péptido y 4 µg de H-2Kb:Ig en solución para una carga óptima de péptido. 4. Mezclar el péptido y la H-2Kb:Ig en PBS, pH 7,2, e incubar a 37 °C durante la noche. La H-2Kb:Ig con péptido puede conservarse a 4 °C hasta una semana. Protocolo 2: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Resuspender las células de ratón en tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN₃ o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.º de cat. 554656], con la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10⁻¹ células por 50 µl. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Añadir aproximadamente 1 x 10⁻¹ células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™, n.º de cat. 352008). 2. Añada de 0,25 a 4 µg de proteína H-2Kb:Ig cargada con péptido a la suspensión celular. Durante este paso, también puede añadir a la suspensión celular cualquier anticuerpo específico contra un marcador de superficie celular. Incube durante 60 minutos a 4 °C. 3. Lave las células dos veces con 2 ml de tampón FACS, centrifugue durante 5 minutos a 250 xg y deseche el sobrenadante. Resuspenda el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de Citometría de Flujo Multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.