BD, 553481, estándar de isotipo κ de IgE de ratón purificada BD Pharmingen™

Nombre alternativo: dansilo; DNS; 5-[dimetilamino] naftaleno-1-sulfonilo
Isotipo: IgE de ratón C.SW, κ
Aplicación: Estándar ELISA (probado rutinariamente)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_10050441
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. Conservar sin diluir a 4 °C.
Procedimientos de ensayo recomendados: El clon 27-74 es útil como estándar en ELISA. Consulte el protocolo ELISA de IgE de ratón a continuación. PROTOCOLO ELISA DE IgE DE RATÓN Recubrimiento con anticuerpo de captura: 1. Diluya el mAb de captura de IgE antirratón purificado (n.º de cat. 553413, clon R35-72) a 2 µg/ml en tampón de recubrimiento.* Añada 100 µl por pocillo a una placa ELISA de unión a proteínas mejorada (p. ej., placas ELISA BD Falcon™, BD Labware n.º de cat. 353279). 2. Agite la placa para asegurarse de que todos los pocillos estén cubiertos por la solución de anticuerpo de captura. 3. Cubra la placa e incube durante 1 hora a 37 °C o durante la noche a 4 °C. 4. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween*. Para cada lavado, los pocillos se llenan con 200 µl de PBS/Tween y se dejan reposar al menos 1 minuto antes de aspirar o vaciar. Como paso final, golpee la placa sobre toallas de papel para eliminar el exceso de tampón. Bloqueo: 1. Bloquee la placa con 200 µl de tampón de bloqueo* por pocillo. 2. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lave la placa tres veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. Aplicación de estándares y muestras: 1. Deje la columna 1 como pocillos en blanco (es decir, sin añadir antígeno, solo 100 µl de tampón de bloqueo por pocillo). Utilice las columnas 2 y 3 para duplicados del estándar, 100 µl por pocillo: diluya el estándar de IgE de ratón purificado (n.º de cat. 557079, clon C38-2; o n.º de cat. 553481, clon 27-74) o el estándar de IgE de ratón (n.º de cat. 557080, clon C48-2) en una serie de 8 diluciones dobles, en tampón de bloqueo, comenzando con 0,5 µg/ml. Utilice las columnas restantes para añadir muestras a diversas diluciones en tampón de bloqueo, 100 µl por pocillo. 2. Cubra la placa e incube durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. 3. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. Incubación con anticuerpo de detección: 1. Diluir la IgE antirratón biotinilada (n.° de cat. 553419, clon R35-118) a 2 µg/ml en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. 3. Lavar la placa 6 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. Añadir avidina o estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Av-HRP o SAv-HRP): 1. Diluir Av-HRP (n.° de cat. 554058) o SAv-HRP (n.° de cat. 554066) 1:1000 en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lave la placa 6 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. Añada el sustrato y desarrolle: 1. Descongele el tampón de sustrato (ABTS)* dentro de los 20 minutos posteriores a su uso. Añada 11 µl de H₂O₂ al 30 % (Sigma, n.° de cat. H1009) a 11 ml de tampón de sustrato y agite en vórtex. Añada inmediatamente 100 µl por pocillo y deje desarrollar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. La reacción de color puede detenerse añadiendo 50 µl por pocillo de solución SDS/DMF* (opcional). 2. Lea la placa a 405 nm. *SOLUCIONES Tampón de recubrimiento PBS/Tween Tampón de sustrato PBS, pH 7,2 - 7,4 PBS ABTS (ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfónico, Sigma Cat. No. A-1888) 150 mg Tween-20 0,05 % Ácido cítrico 0,1 M (p. ej., Fisher anhidro, Cat. No. A-940) 500 ml Ajuste el pH a 4,35 con pellets de NaOH. Alicuote a 11 ml por vial y almacene a -20 °C Solución PBS Tampón de bloqueo NaCl 80,0 g PBS Na2HPO4 11,6 g Suero fetal bovino Solución SDS/DMF al 10 % KH2PO4 2,0 ​​g o BSA al 1 % SDS al 40 % (80 g SDS en 200 ml H2O dd) KCl 2,0 g Agregue 200 ml DMF (NN-dimetilformamida) ddH₂O a 10 litros. Ajustar el pH a 7,2-7,4. NOTAS a. En la mayoría de los casos, recubrir la placa con mAb primario a 2 µg/ml, 100 µl por pocillo y detectar con el mAb secundario biotinilado a 2 µg/ml, 100 µl por pocillo produce una señal muy satisfactoria. Sin embargo, para una señal óptima, los investigadores deben titular cada mAb en un rango de concentraciones (p. ej., 1-8 µg/ml). b. Condiciones de incubación recomendadas para una sensibilidad óptima. c. El conjugado de estreptavidina/avidina-HRP de otro proveedor puede sustituirse y diluirse según las recomendaciones del fabricante.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben usarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo.