BD, 555248, Conjunto ELISA de IgE de ratón BD OptEIA™

Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869051
Descripción: Descripción El set BD OptEIA™ para inmunoglobulina E (IgE) de ratón contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para IgE de ratón en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización del ensayo Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: títulos de anticuerpos de captura/detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente del ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnicas de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: Este inmunoensayo está calibrado contra IgE de ratón purificada, κ monoclonal (anti-TNP) producida en BD Biosciences Pharmingen.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5 con NaOH 10 N. Prepare fresco o utilice en un plazo de 7 días desde su preparación, almacene a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. También se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs. a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación; almacenar a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación; almacenar a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. También se recomienda el juego de reactivos de sustrato BD Pharmingen™ TMB (n.º de cat. 555214). 5. Solución de parada: H3PO4 1 M o H2SO4 2 N Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan las placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279). 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta de un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado por centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y deje que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: Recoja el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar a temperatura ambiente, abra cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de hacer diluciones. Agite suavemente con vórtex para mezclar. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, inmediatamente** alícuota la solución madre del estándar a 50 µl por vial y congélela a ≤ -70 °C durante un máximo de 6 meses. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. **Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 100 ng/mL a partir de la solución madre del estándar. Agite con vórtex para mezclar. b. Agregue 300 µL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquete como 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,3 ng/mL, 3,1 ng/mL y 1,6 ng/mL. c. Realice diluciones seriadas añadiendo 300 µL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 ng/mL). Procedimiento de ensayo recomendado: 1. Recubra los micropocillos con 100 µL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento recomendada del anticuerpo, consulte las instrucciones o el certificado de análisis específicos del lote. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire los pocillos y lave 3 veces con ≥ 300 µL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 µL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 µL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Selle la placa e incube durante 2 horas a TA. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 5 lavados en total. 8. Agregue 100 µL de detector de trabajo preparado (anticuerpo de detección + reactivo SAv-HRP) a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a TA. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este paso de lavado final, sumerja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto por cada lavado. 10. Agregue 100 µL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a TA en la oscuridad. 11. Agregue 50 µL de solución de parada a cada pocillo. 12. Lea la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 minutos de detener la reacción. Si la corrección de longitud de onda está disponible, reste la absorbancia de 570 nm de la absorbancia de 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añada 100 µL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire y lave 3 veces. 3. Bloquee las placas: 200 µL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incube 1 hora a temperatura ambiente. 4. Aspire y lave 3 veces. 5. Añada 100 µL de estándar o muestra a cada pocillo. Incube 2 horas a temperatura ambiente. 6. Aspire y lave 5 veces. 7. Añada 100 µL de detector de trabajo (Ab de detección + SAv-HRP) a cada pocillo. Incube 1 hora a temperatura ambiente. 8. Aspire y lave 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min). 9. Añada 100 µL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. 10. Añada 50 µL de solución de parada a cada pocillo. Lea a 450 nm en 30 min con corrección λ a 570 nm. Cálculo de los resultados Calcule la absorbancia media de cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Reste la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Dibuje la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de IgE en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibuje la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de IgE de las muestras desconocidas, encuentre el valor de absorbancia media de la muestra desconocida en el eje y y dibuje una línea horizontal hasta la curva estándar. En el punto de intersección, dibuje una línea vertical hasta el eje x y lea la concentración de IgE. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de IgE por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos por ordenador, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Especificidad Reactividad cruzada: Los siguientes isotipos se analizaron en el BD OptEIA. Ensayo a 2 µg/mL y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 2 ng/mL). Ratón: IgG1, κ; IgG1, λ; Ig2a, κ; IgG2b, κ; IgG2b, λ; IgG3, κ; IgG3, λ; IgM, κ; IgM, λ; IgA, κ
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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