BD, 555260, Conjunto ELISA MCP-1 para ratón BD OptEIA™

Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869054
Descripción: Descripción El set OptEIA™ para proteína quimiotáctica de monocitos de ratón 1 (MCP-1) contiene los componentes necesarios para desarrollar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para MCP-1 de ratón natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización del ensayo Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteína, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: este inmunoensayo está calibrado frente a MCP-1 de ratón recombinante expresado en baculovirus purificado.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ A (n.º de cat. 550536) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: 0,2 M de fosfato de sodio, pH 6,5: 12,49 g de Na₂HPO₄, 15,47 g de NaH₂PO₄; cs a 1,0 L; pH a 6,5. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato BD Pharmingen™ TMB (n.º de cat. 555214). 5. Solución de parada: H3PO4 1 M o H2SO4 2 N. Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan las placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279). 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm. 3. Pipetas de precisión. 4. Probeta de un litro. 5. Agua desionizada o destilada. 6. Frasco de lavado o lavador automático. 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática. 8. Tubos para preparar diluciones estándar. 9. Cronómetro de laboratorio. 10. Selladores de placas o parafilm. Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado por centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y deje que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: Recoja el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra el vial con cuidado para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Mezcle suavemente con vórtex. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, alícuota inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 μl por vial y congélela a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 1000 pg/mL a partir de la solución madre del estándar. Mezcle con vórtex. (Consulte las instrucciones de dilución en el Certificado de instrucciones/análisis). b. Añada 300 μL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquetar como 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL y 15,6 pg/mL. c. Realizar diluciones seriadas añadiendo 300 μL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Preparación del detector de trabajo Añadir el volumen necesario de anticuerpo de detección al diluyente de ensayo. Para ver las diluciones recomendadas, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Para una placa de 96 pocillos llena, preparar 12 mL de detector de trabajo. Desechar cualquier detector de trabajo restante después de su uso. Procedimiento detallado del ensayo 1. Recubrir los micropocillos con 100 μL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para ver la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire los pocillos y lave 3 veces con ≥ 300 μL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 μL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare diluciones estándar y de muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 μL de cada estándar, muestra y control en los pocillos apropiados. Selle la placa e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 8. Añada 100 μL de detector de trabajo a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. 9. Aspirar/lavar como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. 10. Añadir 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 11. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo. 12. Leer la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 minutos de detener la reacción. Si la corrección de longitud de onda está disponible, restar la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añadir 100 μL de Capture Ab diluido a cada pocillo. Incubar durante la noche a 4 °C. 2. Aspirar y lavar 3 veces. 3. Bloquear las placas: 200 μL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. 4. Aspirar y lavar 3 veces. 5. Añadir 100 μL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 h RT. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Añadir 100 μL de detector de trabajo a cada pocillo. Incubar 1 h RT. 8. Aspirar y lavar 7 veces. 9. Añadir 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 min RT en oscuridad. 10. Añadir 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm en 30 min con corrección λ de 570 nm. Cálculo de resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia estándar media cero de cada uno. Graficar la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de MCP-1 en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de MCP-1 de las incógnitas, encontrar el valor de absorbancia media de la incógnita en el eje y y dibujar una línea horizontal hasta la curva estándar. En el punto de intersección, trace una línea vertical hacia el eje x y lea la concentración de MCP-1. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de MCP-1 por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos computacional mediante un análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se analizaron en el ensayo BD OptEIA™ a ≥ 10 ng/mL y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 4 pg/mL). Humano recombinante: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, CD23, Linfotactina, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, MCP-2, NT-3, PDGF-AA, SCF, TNF, LT-α (TNF-β), VEGF de ratón recombinante: IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-15, IFN-γ, GM-CSF, TCA3, TNF recombinante de rata: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF. Otros: IL-10 viral (1 ng/mL), TNF de conejo. Limitaciones del procedimiento: · Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. · No se ha investigado exhaustivamente la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede descartar la posibilidad de interferencia. · Los sets BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del set. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
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