BD, 555670, BD Pharmingen™ Anti-CD95 humano purificado de ratón NA/LE

Nombre alternativo: APO-1; FAS; TNFRSF6; APT1; ALPS1A; FAS1; FASTM; receptor FASLG
Reactividad: Humano (prueba de control de calidad), Rhesus, Cynomolgus, Babuino (probado en desarrollo)
Isotipo: C3H de ratón, también conocido como C3H/He, C3H/Bi IgG1, κ
Inmunógeno: células L humanas transfectadas con CD95
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente), ensayo funcional (probado durante el desarrollo)
Concentración: 1,0 mg/ml
Número de taller: VI C-64
ID de registro: AB_396023
Tampón de almacenamiento: Sin azida/bajo endotoxina: Solución acuosa tamponada sin conservantes, filtrada estérilmente a 0,2 µm. El nivel de endotoxina es ≤0,01 UE/µg (≤0,001 ng/µg) de proteína, según lo determinado por el ensayo LAL.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. Esta preparación no contiene conservantes, por lo que debe manipularse en condiciones asépticas.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Se informa a los investigadores que el siguiente procedimiento no se prueba de forma rutinaria para este material. Inducción de apoptosis utilizando anti-CD95 humano de ratón purificado (clon DX2) [MN 555670] Materiales adicionales necesarios: Línea celular de control positivo (p. ej., Daudi, HPB-ALL, Jurkat) Proteína G recombinante (rProt G) (SIGMA, n.º de cat. P4689) Placa de microtitulación de 96 pocillos Medio IMDM o RPMI 1640 con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1 % de L-glutamina, 1 % de antibióticos (medio FBS) Procedimiento: 1. Mantener las células en cultivo con medio FBS al 10 %; cambiar el medio un día antes de comenzar la inducción de apoptosis. Coseche y sedimente las células, resuspéndalas en medio FBS al 10 % a una densidad de 0,5-1,0 x 10^6 células/ml. 2. En una microplaca de 96 pocillos, añada 2,5 µg/50 µl de CD95 NA/LE™, 0,5 µg/50 µl de rProt G, 0,5-1,0 x 10^5 células y medio FBS al 10 % hasta un volumen total de 200 µl. Los controles negativos deben consistir en: 1) 0,5-1,0 x 10^5 células con medio FBS al 10 % solo (volumen total de 200 µl), y 2) 0,5-1,0 x 10^5 células con 0,5 µg/50 µl de rProt G y medio FBS al 10 %. 3. Incubar la placa de 96 pocillos a 37 °C, 5 % de CO₂, durante 12-24 horas. Tradicionalmente, la apoptosis se ha observado mediante microscopía óptica, MTT o electroforesis en gel (fragmentación de ADN). Los investigadores pueden estar interesados ​​en varios productos de BD Biosciences que pueden utilizarse para la detección de células apoptóticas mediante citometría de flujo: Kit ApoDirect™ (n.º de cat. 556381), Kit ApoBRDU™ (n.º de cat. 556405) y Annexin V-FITC (n.º de cat. 556420 o 556419). Debido a la sensibilidad variable de estos métodos, puede ser necesario titular rProtG o CD95 NA/LE™ para obtener resultados óptimos. Notas: Las sugerencias de este procedimiento se basan en condiciones óptimas para la inducción de la apoptosis mediante anti-CD95 humano (Fas). Estudios han demostrado que la adición de proteína G puede mejorar significativamente la eficiencia de DX2 en este tipo de ensayo funcional. Es importante destacar que existe una gran variación entre líneas celulares en el nivel de apoptosis que puede inducirse a través del receptor Fas. Se ha reportado que, aunque algunas células expresan el antígeno Fas, no necesariamente experimentan apoptosis mediada por Fas (es decir, el antígeno Fas expresado puede ser sensible o insensible a anti-Fas). Las células Daudi, Jurkat y HPB-ALL son buenos controles positivos, ya que son fuertemente inducidas por anti-Fas para experimentar apoptosis.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. Es posible que la reactividad cruzada entre especies detectada durante el desarrollo del producto no se haya confirmado en todos los formatos o aplicaciones. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.