BD, 556003, BD Pharmingen™ Anti-Ki-67 de ratón purificado

Nombre alternativo: MKI67; Antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal Ki-67; KIA
Reactividad: Humana (prueba de control de calidad), Ratón (probado en desarrollo), Rata, Rhesus (reportado)
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: Ki-67 humano
Aplicación: Bioimagen, tinción intracelular (citometría de flujo) (probada rutinariamente), Western blot (no recomendado)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_396287
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROTOCOLO DE TINCIÓN PARA CITOMETRÍA DE FLUJO: 1. Coseche, cuente y sedimente las células siguiendo los procedimientos estándar (Nota: Ki-67 se expresa en las células proliferativas. Es posible que no obtenga tinción con las células en reposo, p. ej., PBMC no estimuladas). 2. Mientras se realiza la votación, agregue 5 ml gota a gota de etanol frío al 70-80% al sedimento de células (1-5x10^7 células). Luego incube a -20 °C durante 2 horas como mínimo. Estas células fijadas se pueden usar hasta 60 días después de la fijación (almacene a -20 °C). 3. Agregue 30-40 ml de tampón de lavado (PBS con 1% FBS, 0.09% NaN3, pH 7.2) a las células fijadas. Centrifugue las células durante 10 minutos a 1000 rpm y aspire el sobrenadante. Lave una vez más con 30-40 ml de tampón de lavado. Centrifugue a 1000 rpm durante 10 minutos y aspire el sobrenadante. 4. Resuspenda las células a una concentración de 1 x 10^7/ml (1 x 10^6/100 µl). 5. Transfiera 100 µl de suspensión celular a cada tubo nuevo. 6. Añada 20 µl de anticuerpo diluido adecuadamente según el protocolo en los tubos anteriores. Mezcle suavemente. 7. Incube los tubos a temperatura ambiente (TA) durante 20-30 minutos en la oscuridad. 8. Lave con 2 ml de tampón de lavado PBS a 1000 rpm durante 5 minutos. 9. Aspire el sobrenadante. 10. Para el anticuerpo conjugado directo: vaya a los pasos 13 y 14. 11. Para el anticuerpo purificado: añada 50 µl de anticuerpo secundario diluido a una concentración óptima (n.º de cat. 555988), incube a TA durante 30 minutos en la oscuridad. 12. Repita los pasos 8 y 9. 13. Añada 0,5 ml de tampón de lavado PBS a cada tubo. Para el anticuerpo conjugado con FITC, añada µl de solución de tinción PI (n.º de cat. 556463); para el anticuerpo conjugado con PE, añada 20 µl de solución de viabilidad celular BD Via-Probe™ (n.º de cat. 555816) a cada tubo. 14. Analice la muestra con FACS. PROTOCOLO DE TINCIÓN PARA BIOIMAGEN: Metanol Procedimiento para una placa de 96 pocillos: Retire el medio de los pocillos. Añada 100 µl/pocillo de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Retire y añada 100 µl/pocillo de metanol al 90 %. Incube durante 5 minutos a TA. Retire y lave dos veces con PBS. Saque el PBS y añada 100 µl/pocillo de tampón de bloqueo (3 % FBS en PBS). Incube durante 30 minutos a TA. Saque el PBS y añada el anticuerpo diluido (diluido en tampón de bloqueo). Incube durante 1 hora a TA. Lave tres veces con PBS. Saque el PBS y añada el reactivo del segundo paso. Incube durante 1 hora a TA. Lave tres veces con PBS. Obtenga imágenes de la muestra. Triton-X 100 Procedimiento para una placa de 96 pocillos: Retire el medio de los pocillos. Añada 100 µl/pocillo de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Saque el PBS y añada 100 µl/pocillo de Triton™ X-100 al 0,1 %. Incube durante 5 minutos a TA. Saque el PBS y lave dos veces con PBS. Saque el PBS y añada 100 µl/pocillo de tampón de bloqueo (3 % FBS en PBS). Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retirar y añadir el anticuerpo diluido (diluido en tampón de bloqueo). Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retirar y lavar tres veces con PBS. Retirar y añadir el reactivo del segundo paso. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retirar y lavar tres veces con PBS. Obtener una imagen de la muestra.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Este anticuerpo ha sido desarrollado y certificado para la aplicación de bioimagen. Sin embargo, no se realiza una prueba de bioimagen de rutina en cada lote. Se recomienda a los investigadores titular el reactivo para un rendimiento óptimo. La reactividad cruzada de especies detectada en el desarrollo del producto puede no haber sido confirmada en todos los formatos y/o aplicaciones. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben utilizarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo en endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo. Triton es una marca registrada de Dow Chemical Company. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.