BD, 556381, Kit BD Pharmingen™ APO-DIRECT™

Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869067
Descripción: Uno de los pasos posteriores de la apoptosis es la fragmentación del ADN, un proceso resultante de la activación de endonucleasas durante el programa apoptótico. Estas nucleasas degradan la estructura de la cromatina de orden superior en fragmentos de ~300 kb y, posteriormente, en fragmentos de ADN más pequeños de aproximadamente 50 pb. Un método frecuente para detectar ADN fragmentado utiliza una reacción catalizada por TdT exógena, a menudo denominada "marcaje final" o "TUNEL" (marcaje de extremos de mellas con dUTP de desoxinucleotidiltransferasa terminal). El ensayo APO-DIRECT™ (n.° de cat. 6536KK) es un método de un solo paso para marcar roturas de ADN con FITC-dUTP, seguido de un análisis por citometría de flujo. En el ensayo APO-BRDU™, la TdT cataliza la adición, independiente del molde, de trifosfatos de desoxiuridina bromados (Br-dUTP) a los extremos 3'-hidroxilo (OH) del ADN bicatenario y monocatenario. Tras la incorporación, estos sitios se identifican mediante citometría de flujo tiñendo las células con un mAb anti-BrdU marcado con FITC. APO-DIRECT™ es un método de tinción de un solo paso para marcar roturas de ADN y detectar células apoptóticas mediante citometría de flujo. Se proporcionan suficientes reactivos para procesar 50 pruebas. El kit incluye 5 ml de suspensiones celulares de control positivo y 5 ml de control negativo, aproximadamente 1 x 10^6 células por ml en etanol al 70 % (v/v). Las células de control proceden de una línea celular de linfoma humano y se han fijado como se describe a continuación en el Protocolo de Fijación. El kit APO-DIRECT™ consta de dos partes (parte A y parte B). La Parte A (Comp. No. 51-6536AK) consta de: Un frasco de 25 ml de tampón de tinción PI/RNasa (5 µg/ml, 200 µg/ml de ARNasa) [Comp. No. 51-6551AZ], Un vial de 0,5 ml de tampón de reacción (que contiene ácido cacodílico (dimetilarsénico)) [Comp. No. 51-6549AZ], Un frasco de 100 ml de tampón de enjuague (que contiene 0,05% de azida sódica) [Comp. No. 51-6550AZ] Un frasco de 100 ml de tampón de lavado (que contiene 0,05% de azida sódica) [Comp. No. 51-6548AZ]. Parte B (Comp. No. 51-6536BK) consta de: Un frasco de 0,4 ml de FITC-dUTP (0,25 nMol) [Comp. No. 51-6555EZ] Un frasco de 5 ml de células de control negativo [contiene 70% (v/v) de etanol] [Comp. No. 51-6553LZ] Un frasco de 5 ml de células de control positivo [contiene 70% (v/v) de etanol] [Comp. No. 51-6552LZ] Un frasco de 0,038 ml de enzima TdT [200 µg/ml (SA= 100.000 U/mg) en solución de glicerol al 50% (v/v); no se congela a -20 °C] [Comp. No. 51-6554EZ].
Preparación y almacenamiento: El kit APO-DIRECT™ consta de dos partes (A y B). La parte A (n.º de comp. 51-6536AK) se envía a temperatura ambiente y debe almacenarse a 4 °C a su llegada. La parte B (n.º de comp. 51-6536BK) se envía a –80 °C en hielo seco y debe almacenarse a –20 °C a su llegada. BD Biosciences Pharmingen ha determinado que este método de envío es adecuado para mantener la integridad de los componentes del kit.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados MÉTODOS PARA LA FIJACIÓN, TINCIÓN Y ANÁLISIS DE MUESTRAS APO-DIRECT™ Protocolo de fijación Este es un protocolo estándar utilizado en BD Biosciences Pharmingen para las pruebas de control de calidad del kit APO-DIRECT™. La fijación celular con paraformaldehído es un paso obligatorio en el ensayo APO-DIRECT™. El siguiente procedimiento de fijación celular es un método sugerido. Las variables como el origen celular y las condiciones de crecimiento pueden afectar los resultados. Las condiciones de fijación proporcionadas a continuación deben considerarse como directrices. Es posible que se requiera experimentación adicional para obtener resultados comparables a las células de control proporcionadas con este kit. Las células de control positivas y negativas proporcionadas en el kit APODIRECT™ ya están fijadas. 1. Suspenda las células en paraformaldehído al 1 % (p/v) en PBS (pH 7,4) a una concentración de 1-2 x 10^6 células/ml. 2. Coloque la suspensión celular en hielo durante 30-60 minutos. 3. Centrifugue las células durante 5 minutos a 300 xg y deseche el sobrenadante. 4. Lave las células en 5 ml de PBS, luego sedimente las células por centrifugación. Repita el lavado y la centrifugación. 5. Resuspenda el sedimento celular en el PBS residual en el tubo agitando suavemente el tubo. 6. Ajuste la concentración celular a 1-2 x 10^6 células/ml en etanol al 70% (v/v) helado. Deje reposar las células durante un mínimo de 30 minutos en hielo o en el congelador. Vea la nota a continuación. 7. Almacene las células en etanol al 70% (v/v) a -20 °C hasta su uso. Las células se pueden almacenar a -20 °C varios días antes de su uso. Nota: En algunos sistemas biológicos, el almacenamiento de las células a -20 °C en etanol al 70 % (v/v) durante al menos 12-18 horas antes de la tinción para la detección de apoptosis produce los mejores resultados. Las células se pueden almacenar a -20 °C durante varios meses antes de su uso. Protocolo de tinción El siguiente protocolo describe el método para medir la apoptosis en las células de control positivas y negativas que se proporcionan en el kit APO-DIRECT™. Se debe emplear el mismo procedimiento para medir la apoptosis en las muestras de células proporcionadas por el investigador. 1. Resuspenda las células de control positivas (51-6552LZ) y negativas (51-6553LZ) agitando los viales. Retire alícuotas de 1 ml de las suspensiones de células de control (aproximadamente 1 x 10^6 células/ml) y colóquelas en tubos de centrífuga de 12 x 75 mm. Centrifugue las suspensiones de células de control durante 5 min a 300 xg y extraiga el etanol al 70 % (v/v) por aspiración, evitando alterar el sedimento celular. 2. Resuspenda cada tubo de células de control con 1,0 ml de tampón de lavado (51-6548AZ). Centrifugue como antes y extraiga el sobrenadante por aspiración. 3. Repita el tratamiento con el tampón de lavado (Paso 2). 4. Resuspenda cada tubo de sedimento de células de control en 50 µl de la solución de marcaje de ADN (preparada como se describe a continuación). Para un ensayo, utilice las siguientes cantidades de soluciones de etiquetado de ADN: Solución de etiquetado de ADN 1 ensayo 6 ensayos 12 ensayos Tampón de reacción (tapa verde) 10,00 μl 60,00 μl 120,00 μl Enzima TdT (tapa amarilla) 0,75 μl 4,50 μl 9,00 μl FITC dUTP (tapa naranja) 8,00 μl 48,00 μl 96,00 μl H2O destilada 32,25 μl 193,50 μl 387,00 μl Volumen total 51,00 μl 306,00 μl 612,00 μl 5. Incubar las células en la solución de etiquetado de ADN durante 60 min a 37 °C. La reacción también puede llevarse a cabo a TA durante la noche para las células de control. Para las muestras de prueba, el tiempo de incubación de 60 min a 37 °C puede necesitar ajustarse a períodos de tiempo más largos. 6. Al final del tiempo de incubación, agregue 1,0 ml de tampón de enjuague (51-6550AZ) a cada tubo y centrifugue cada tubo a 300 xg durante 5 min. Retire el sobrenadante por aspiración. 7. Repita el enjuague celular con 1,0 ml de tampón de enjuague, centrifugue y retire el sobrenadante por aspiración. 8. Resuspenda el pellet celular en 0,5 ml del tampón de tinción PI/RNasa (51-6551AZ). Nota: Si la densidad celular es baja, reduzca la cantidad de tampón de tinción PI/RNasa a 0,3 ml. 9. Incube las células en la oscuridad durante 30 min a TA. 10. Analice las células en solución de PI/RNasa mediante citometría de flujo. 11. Analice las células dentro de las 3 horas posteriores a la tinción. Las células pueden comenzar a deteriorarse si se dejan durante la noche antes del análisis. Análisis de muestras APO-DIRECT™ mediante citometría de flujo Este ensayo se realiza en un citómetro de flujo equipado con un láser de argón de 488 nm como fuente de luz. Los resultados esperados utilizando las células de control positivo y negativo se muestran en las Figs. 1 y 2. Se utilizan dos colorantes; PI tiñe el ADN total y FITC-dUTP tiñe las células apoptóticas. PI fluoresce a aproximadamente 623 nm y FITC a 520 nm. Se crean dos pantallas de parámetros duales y dos de parámetros simples con el software de adquisición de datos del citómetro de flujo. La pantalla de selección debe ser la pantalla estándar de discriminación de dobletes de ADN de parámetros duales con la señal del área de ADN en el eje Y y el ancho de ADN en el eje X (Fig. 1). A partir de esta visualización, se dibuja una compuerta alrededor de las células no agrupadas y se genera la segunda visualización de parámetros duales compuerta. La convención normal de esta visualización es colocar el ADN (fluorescencia roja lineal) en el eje X y el FITCdUTP (fluorescencia verde logarítmica) en el eje Y. También se pueden agregar dos histogramas de parámetros individuales compuerta, ADN y FITC-dUTP, pero no son necesarios. Al usar el método de visualización de parámetros duales, no solo se resuelven las células apoptóticas, sino que también se determina su etapa del ciclo celular. CONSEJOS TÉCNICOS Y PREGUNTAS FRECUENTES 1. Para los investigadores que utilizan sistemas de líneas celulares adherentes, las células en el sobrenadante tienen una mayor probabilidad de ser apoptóticas que las células adherentes. Guarde las células en el sobrenadante para usarlas en el ensayo antes de la tripsinización de la capa de células adherentes. 2. La fijación celular usando un fijador químico de entrecruzamiento de ADN (por ejemplo, paraformaldehído) es un paso importante en el análisis de la apoptosis. Las células no fijadas pueden perder fragmentos más pequeños de ADN que no están fijados químicamente en su lugar dentro de la célula antes de los pasos de lavado. El investigador puede tener que explorar métodos alternativos de fijación y permeabilización para explotar completamente sus sistemas. 3. Se puede preparar un portaobjetos de citología por citocentrifugación o centrífuga a partir de la muestra de APO-DIRECT™ de la siguiente manera: Después de completar la tinción con FITC-dUTP, pero antes del tratamiento con PI/RNasa, coloque una gota de las células teñidas en un portaobjetos, centrifugúelo y observe la muestra bajo un microscopio de fluorescencia. 4. Para minimizar la pérdida de células durante el ensayo, recomendamos el uso de tubos de poliestireno de 12 x 75 mm durante todo el procedimiento de tinción y el análisis. Con otros tipos de tubos o plásticos (p. ej., polipropileno), las células pueden acumularse en los lados de los tubos, lo que resulta en una pérdida significativa del número de células, así como en una tinción ineficiente de aquellas células que no están completamente expuestas a los reactivos de tinción. También recomendamos que, después de los pasos de lavado, las células se resuspendan mediante una mezcla suave y no mediante pipeteo, ya que las puntas de pipeta de plástico también pueden contribuir a la pérdida de células durante el ensayo. 5. Ocasionalmente, se observa una población de células en imagen especular a menor intensidad en la pantalla de parámetros duales de la citometría de flujo. Esta población surge durante la reacción de marcaje, cuando algunas células se pegan al costado del tubo de ensayo y no están completamente expuestas a la solución de marcaje. Este fenómeno se puede superar lavando todas las células del costado del tubo y asegurándose de que todas las células estén correctamente suspendidas al comienzo de la reacción de marcaje. 6. Si se observa una baja intensidad de tinción con FITC, intente aumentar el tiempo de incubación durante la reacción de tinción con FITC-dUTP. 7. No se requiere información del ciclo celular del ADN, no es necesario agregar el tampón de tinción de PI/RNasa a cada tubo. Advertencia: El tampón de lavado (componente 51-6548AZ) y el tampón de reacción (componente 51-6549AZ) contienen 0,2 % de ácido cacodílico (p/p). Indicaciones de peligro: Se sospecha que causa cáncer. Declaraciones de precaución: Llevar ropa de protección/protección ocular. Llevar guantes de protección. SI se expone o sospecha: Consultar a un médico. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. Peligro: Las células de control negativo (componente 51-6553LZ) y las células de control positivo (componente 51-6552LZ) contienen 56,0 % de etanol (p/p). Indicaciones de peligro Líquido y vapores muy inflamables. Provoca irritación ocular grave. Declaraciones de precaución Mantener alejado del calor, chispas, llamas abiertas y superficies calientes. No fumar. Llevar guantes, ropa de protección, protección ocular y facial. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quitarse inmediatamente todas las prendas contaminadas. Enjuagarse la piel con agua/ducharse. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con abundante agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir enjuagando. Conservar en un lugar bien ventilado. Mantener en un lugar fresco. Mantener el recipiente bien cerrado. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con la normativa local, regional, nacional e internacional.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.
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