BD, 556416, BD Pharmingen™ Anexina V recombinante purificada

Aplicación: Bloqueo, citometría de flujo (probado rutinariamente)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2869069
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar el producto a -80 °C antes de su uso o para el almacenamiento prolongado de soluciones madre. Evitar la congelación y descongelación repetidas del producto. La anexina V recombinante se expresó en bacterias y presenta una pureza ≥95 % según lo determinado por SDS/PAGE teñido con azul de Coomassie.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados La anexina V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10e-2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de la anexina V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de anexina V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis citométrico de flujo de anexina V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar anexina V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar la Anexina V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare una solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 x 10e6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el Protocolo de tinción de Anexina V para medir la apoptosis. INDUCCIÓN DE APOPTOSIS USANDO UN ANTICUERPO ANTI-CD95 HUMANO (FAS) El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar la Anexina V en una línea celular humana. Materiales 1. Una línea celular o células primarias que pueden ser fácilmente inducidas a apoptosis por mAb Fas humano. Algunos ejemplos incluyen células de linfoma Daudi (ATCC CCL-213) y células T Jurkat (ATCC TIB-152). Es importante destacar que puede haber una variación significativa entre líneas celulares con respecto al nivel de apoptosis que puede ser inducida a través del receptor Fas. Además, no todos los tipos de células que expresan el antígeno Fas necesariamente experimentarán apoptosis mediada por Fas. Las líneas celulares mencionadas anteriormente son buenos controles positivos, ya que son fuertemente inducidas a apoptosis por mAb Fas. 2. mAb anti-CD95 (Fas) humano, clon DX2 (Cat. No. 555670). 3. Proteína G recombinante (Sigma-Aldrich cat.no. P4689). Hemos encontrado que la adición de proteína G al medio de cultivo tisular puede mejorar significativamente la eficiencia del clon DX2 para inducir la apoptosis. 4. Matraces de cultivo tisular T25. 5. Medio IMDM o RPMI 1640 con 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 1 % de L-glutamina y 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina; 100 U/ml). Este medio suplementado se denomina simplemente «medio» en adelante. Procedimiento 1. Mantener las células en cultivo y cambiar el medio un día antes de inducir la apoptosis. 2. Inducción de la apoptosis: Añadir 0,5-2 µg/ml del anticuerpo anti-CD95 (clon DX2) y 1-2 µg/ml de proteína G a un matraz T25 con medio que contenga ~0,5 × 10⁻¹ células/ml. Los controles negativos deben consistir en: (a) ~0,5 × 10e6 células/ml con medio solo (sin mAb ni proteína G), y (b) ~0,5 × 10e6 células/ml con medio y 1 µg/ml de proteína G sola (sin mAb). 3. Incubar las células de 2 a 12 horas a 37 °C. 4. Proceder con el protocolo de tinción de anexina V para medir la apoptosis. La apoptosis también puede observarse mediante microscopía óptica, electroforesis en gel (escaleras de fragmentación de ADN) o utilizando un sistema de ensayo de citometría de flujo basado en la fragmentación de ADN, como el kit APO-BRDU™ (n.º de cat. 556405) o el kit APO-DIRECT™ (n.º de cat. 556381). PROTOCOLO DE TINCIÓN Y BLOQUEO DE ANEXINA V Reactivos 1. Biotina (n.º de cat. 556418), FITC (n.º de cat. 556420), PE (n.º de cat. 556422), APC (n.º de cat. 550474), Cy5 (n.º de cat. 559933) o Cy5.5 (n.º de cat. 559935) reactivos de anexina V conjugados: no incluidos. Use 5 µl por prueba. 2. 7-aminoactinomicina D (7-AAD): no incluido. 7-AAD (n.º de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Yoduro de propidio (PI): no incluido. PI (n.º de cat. 556463) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar. Use hasta 10 µl por prueba de una solución de 50 µg/ml. La concentración óptima de PI puede variar entre líneas celulares, donde 10 µl de una solución madre de 50 µg/ml es probablemente el máximo requerido. Una cantidad menor puede producir resultados óptimos en algunos sistemas experimentales. 4. Tampón de unión 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Alternativamente, puede adquirir el número de catálogo 556454. 5. Anexina V recombinante purificada (n.º de cat. 556416): Incluida. Tinción 1. Lave las células dos veces con PBS frío y luego resuspéndalas en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10⁻¹ células/ml. 2. Transferir 100 µl de la solución (1 x 10e5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de fluorocromo conjugado-Anexina V (para análisis de uno y dos colores) y/o 5 µl de 7-AAD o 10 µl PI (solo para análisis de dos colores). 4. Agitar suavemente las células e incubar durante 15 min a TA (25 °C) en la oscuridad. 5. Añadir 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analizar por citometría de flujo en 1 h. Bloqueo 1. Lavar las células dos veces con PBS frío y luego resuspender las células en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10e6 células/ml. 2. Transferir 100 µl de la solución (1 x 10e5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añada de 5 a 15 µg de anexina V recombinante purificada. La cantidad de anexina V recombinante purificada necesaria para saturar los sitios de unión puede variar según el tipo celular y la fase de apoptosis. En algunos casos, es posible que los investigadores deban reducir el número de células a 0,5 x 10e5 y añadir de 5 a 15 µg de anexina V recombinante para obtener resultados óptimos. Se recomienda encarecidamente la titulación. 4. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a temperatura ambiente. 5. Añada 5 µl de anexina V conjugada con fluorocromo (para análisis de uno y dos colores) o 5 µl de 7-AAD o 10 µl de PI (solo para análisis de dos colores). 6. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a temperatura ambiente en oscuridad. 7. Añada 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analizar mediante citometría de flujo lo antes posible (dentro de 1 hora).
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.