BD, 556418, BD Pharmingen™ Biotina Anexina V

Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_2869070
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados La biotina anexina V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10e-2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de la biotina anexina V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de biotina anexina V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de biotina anexina V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar anexina V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS USANDO UN ANTICUERPO ANTI-CD95 HUMANO (FAS) El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede usar Biotina Anexina V en una línea celular humana. Materiales 1. Una línea celular o células primarias que puedan ser fácilmente inducidas a sufrir apoptosis por mAb Fas humano. Los ejemplos incluyen células de linfoma Daudi (ATCC CCL-213) y células T Jurkat (ATCC TIB-152). Es importante notar que puede haber una variación significativa entre líneas celulares con respecto al nivel de apoptosis que puede ser inducido a través del receptor Fas. Además, no todos los tipos de células que expresan el antígeno Fas necesariamente sufrirán apoptosis mediada por Fas. Las líneas celulares mencionadas arriba son buenos controles positivos ya que son fuertemente inducidas a sufrir apoptosis por mAb Fas. 2. mAb anti-CD95 (Fas) humano, clon DX2 (Cat. No. 555670). 3. Proteína G recombinante (Sigma-Aldrich n.° de cat. P4689). Se ha observado que la adición de proteína G al medio de cultivo tisular puede mejorar significativamente la eficacia del clon DX2 para inducir la apoptosis. 4. Matraces de cultivo tisular T25. 5. Medio IMDM o RPMI 1640 con 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 1 % de L-glutamina y 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina; 100 U/ml). Este medio suplementado se denomina simplemente «medio» en adelante. Procedimiento 1. Mantener las células en cultivo y cambiar el medio un día antes de inducir la apoptosis. 2. Inducción de apoptosis: Añadir 0,5-2 µg/ml del anticuerpo anti-CD95 (clon DX2) y 1-2 µg/ml de proteína G a un matraz T25 con medio que contenga ~0,5 × 10⁻¹ células/ml. Los controles negativos deben consistir en: (a) ~0,5 × 10⁻¹ células/ml con medio solo (sin mAb ni proteína G), y (b) ~0,5 × 10⁻¹ células/ml con medio y 1 µg/ml de proteína G sola (sin mAb). 3. Incubar las células de 2 a 12 horas a 37 °C. 4. Proceder con el protocolo de tinción con biotina y anexina V para medir la apoptosis. La apoptosis también se puede observar mediante microscopía óptica, electroforesis en gel (escaleras de fragmentación de ADN) o utilizando un sistema de ensayo de citometría de flujo basado en la fragmentación de ADN, como el kit APO-BRDU™ (n.º de cat. 556405) o el kit APO-DIRECT™ (n.º de cat. 556381). INDUCCIÓN DE LA APOPTOSIS USANDO UN ANTICUERPO ANTI-CD95 DE RATÓN (FAS) El siguiente protocolo se proporciona como ilustración de cómo se puede utilizar la biotina anexina V en células murinas. Materiales 1. Una línea celular o células primarias que puedan inducirse fácilmente a sufrir apoptosis mediante el anticuerpo monoclonal Fas de ratón (mAb). Se pueden utilizar timocitos aislados de un ratón BALB/c de 4-6 semanas de edad. 2. AcMo anti-CD95 (Fas) de ratón, clon Jo2 (n.° de cat. 554254). 3. Proteína G recombinante (Sigma-Aldrich, n.° de cat. P4689). Se ha observado que la adición de proteína G al medio de cultivo tisular puede mejorar significativamente la eficacia del AcMo Jo2 para inducir la apoptosis. 4. Matraces de cultivo tisular T25. 5. Medio RPMI-1640 con 10 % de suero bovino fetal (SFB) inactivado por calor, 1 % de L-glutamina y 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina; 100 U/ml). Este medio suplementado se denomina simplemente "medio" en adelante. Procedimiento 1. Aislar timocitos BALB/c del timo de un ratón de 4 a 6 semanas de edad. 2. Inducción de la apoptosis. Añadir 2,5-10 µg/ml de Jo₂ (n.º de cat. 554254) y 1-2 µg/ml de proteína G a un matraz T25 con ~2 × 10⁻¹ timocitos/ml. Los controles negativos deben consistir en (a) ~2 × 10⁻¹ timocitos/ml con medio solo (sin mAb ni proteína G); (b) ~2 × 10⁻¹ timocitos/ml con medio y 1-2 µg/ml de proteína G sola (sin mAb). 3. Incubar las células durante 2-12 h a 37 °C. 4. Proceder con el protocolo de tinción con biotina y anexina V para medir la apoptosis. La apoptosis también se puede observar mediante microscopía óptica, electroforesis en gel (escaleras de fragmentación de ADN) o utilizando un sistema de ensayo de citometría de flujo basado en la fragmentación de ADN, como el kit APO-BRDU™ (n.º de cat. 556405) o el kit APO-DIRECT™ (n.º de cat. 556381). PROTOCOLO DE TINCIÓN DE BIOTINA ANNEXINA V La biotina anexina V se utiliza para determinar cuantitativamente el porcentaje de células dentro de una población que están experimentando apoptosis activamente. Se basa en la propiedad de las células de perder la asimetría de la membrana en las fases tempranas de la apoptosis. En las células apoptóticas, el fosfolípido de membrana fosfatidilserina (PS) se transloca desde la lámina interna de la membrana plasmática a la lámina externa, exponiendo así la PS al ambiente externo. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio que tiene una alta afinidad por la PS y es útil para identificar células apoptóticas con PS expuesta. El yoduro de propidio (PI) es una sonda de viabilidad citométrica de flujo estándar y se utiliza para distinguir las células viables de las no viables. Las células viables con membranas intactas excluyen el PI, mientras que las membranas de las células muertas y dañadas son permeables al PI. Las células que se tiñen de forma positiva para la biotina anexina V y negativa para el PI están en apoptosis. Las células que se tiñen de forma positiva tanto para la biotina anexina V como para el PI están en la etapa final de la apoptosis, están en necrosis o ya están muertas. Las células que se tiñen de forma negativa tanto para la biotina anexina V como para el PI están vivas y no están en apoptosis medible. Reactivos 1. Biotina anexina V: Incluido. Utilice 5 µl por prueba. 2. Yoduro de propidio (PI): No incluido. PI (n.° de cat. 556463) es un colorante de ácidos nucleicos práctico y listo para usar. Use hasta 10 µl por prueba de una solución de 50 µg/ml. 3. Tampón de unión 10×: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Alternativamente, puede adquirir el número de catálogo 556454. 4. FITC-Estreptavidina (n.° de cat. 554060): No incluido. Tinción: 1. Lave las células dos veces con PBS frío y resuspéndalas en tampón de unión 1× a una concentración de 1 × 10⁻¹ células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 × 10⁻¹ células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de Biotina Anexina V. 4. Agitar suavemente las células con vórtex e incubar durante 15 min a TA (25 °C) en oscuridad. 5. Lavar una vez con 1 ml de tampón de unión 1×. 6. Diluir 0,5 µg de FITC-estreptavidina en 100 µl de tampón de unión 1× y añadir al pellet celular. Mezclar suavemente las células. 7. Añadir 10 µl de PI e incubar durante 15 min a TA (25 °C). La concentración óptima de PI puede variar entre líneas celulares, donde 10 µl de un stock de 50 µg/ml es probablemente el máximo necesario. Una cantidad menor puede dar resultados óptimos en algunos sistemas experimentales. 8. Añadir 400 µl de tampón de unión 1× a cada tubo. Analizar por citometría de flujo en 1 h. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células teñidas solo con FITC-Estreptavidina. 2. Células teñidas con Biotina Anexina V + FITC-Estreptavidina (sin IP). 3. Células teñidas con IP + FITC-Estreptavidina (sin Biotina Anexina V). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a sufrir apoptosis para obtener una tinción de control positiva con Biotina Anexina V y/o Biotina Anexina V y IP. Es importante tener en cuenta que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un porcentaje menor de células que son positivas para la apoptosis (Biotina Anexina V positiva, IP negativa o Biotina Anexina V positiva, IP positiva). La población sin tratar se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas de la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas de la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de la apoptosis celular, las células en las últimas etapas de la apoptosis presentarán una membrana dañada y se tiñerán positivamente tanto para PI como para Biotina Anexina V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto por la vía necrótica, ya que en ambos casos las células muertas se tiñerán tanto con Biotina Anexina V como con PI.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.