BD, 557079, Control de isotipo de IgE κ de ratón purificado BD Pharmingen™

Nombre alternativo: anti-TNP
Isotipo: IgE BALB/c de ratón, κ
Inmunógeno: hemocianina de lapa californiana TNP
Aplicación: ELISA, control de isotipo (probado rutinariamente)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_479637
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. Conservar sin diluir a 4 °C.
Procedimientos de ensayo recomendados: Los procedimientos de ensayo recomendados C38-2 son útiles como estándar en un ELISA sándwich de IgE de ratón. PROTOCOLO DE ELISA DE IgE DE RATÓN Notas: En la mayoría de los casos, recubrir la placa con mAb primario a 2 µg/ml, 100 µl por pocillo y detectar con el mAb secundario biotinilado a 2 µg/ml, 100 µl por pocillo produce una señal muy satisfactoria. Sin embargo, para una señal óptima, los investigadores deben titular cada mAb en un rango de concentraciones (p. ej., 1 - 8 µg/ml). Los tiempos de incubación son condiciones recomendadas para una sensibilidad óptima. I. Recubrir con anticuerpo de captura: 1. Diluir el mAb de captura de IgE antirratón purificado (n.º de cat. 553413, clon R35-72) a 2 µg/ml en tampón de recubrimiento. *Consultar la sección Soluciones a continuación. Añada 100 µl por pocillo a una placa ELISA de unión a proteínas mejorada (p. ej., placas ELISA BD Falcon™, BD Labware, n.º de cat. 353279). 2. Golpee ligeramente la placa para asegurarse de que todos los pocillos estén cubiertos por la solución de anticuerpos de captura. 3. Cubra la placa e incube durante 1 hora a 37 °C o durante la noche a 4 °C. 4. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween*. Para cada lavado, los pocillos se llenan con 200 µl de PBS/Tween y se dejan reposar al menos 1 minuto antes de aspirar o vaciar. Como paso final, golpee ligeramente la placa sobre toallas de papel para eliminar el exceso de tampón. II. Bloqueo: 1. Bloquee la placa con 200 µl de tampón de bloqueo* por pocillo. 2. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween, como en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. III. Aplicar estándares y muestras: 1. Dejar la columna 1 como pocillos en blanco (es decir, sin añadir antígeno, 100 µl por pocillo solo de tampón de bloqueo). Usar las columnas 2 y 3 para duplicados del estándar, 100 µl por pocillo: diluir el estándar de IgE de ratón purificado (n.º de cat. 557079, clon C38-2; o n.º de cat. 553481, clon 27-74) o el estándar de IgE de ratón (n.º de cat. 557080, clon C48-2) en una serie de 8 diluciones dobles, en tampón de bloqueo, comenzando con 0,5 µg/ml. Usar las columnas restantes para añadir muestras a diversas diluciones en tampón de bloqueo, 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. 3. Lave la placa 3X con PBS/Tween, como en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. IV. Incubación con anticuerpo de detección: 1. Diluya la IgE antirratón biotinilada (n.º de cat. 553419, clon R35-118) a 2 µg/ml en tampón de bloqueo. Añada 100 µl por pocillo. 2. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 1 hora. 3. Lave la placa 6X con PBS/Tween, como en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. V. Añada avidina o estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Av-HRP o SAv-HRP): 1. Diluya Av-HRP (n.º de cat. 554058) o SAv-HRP (n.º de cat. 554066) 1:1000 en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lavar la placa 6 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. VI. Añadir el sustrato y desarrollar: 1. Descongelar el tampón de sustrato (ABTS)* en los 20 minutos siguientes a su uso. Añadir 11 µl de H₂O₂ al 30 % (Sigma, n.º de cat. H1009) a 11 ml de tampón de sustrato y agitar en vórtex. Añadir inmediatamente 100 µl por pocillo y dejar desarrollar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. La reacción de color puede detenerse añadiendo 50 µl por pocillo de solución SDS/DMF* (opcional). 2. Leer la placa a 405 nm.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben usarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo.