BD, 557080, Estándar de control de isotipo κ de IgE de ratón purificada BD Pharmingen™

Nombre alternativo: alotipo b, anti-trinitrofenol
Isotipo: Ratón C57BL/6 IgE, κ
Inmunógeno: TNP-hemocianina de lapa californiana
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_396578
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. Conservar sin diluir a 4 °C.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROTOCOLO ELISA DE IgE DE RATÓN I. Recubrimiento con anticuerpo de captura: 1. Diluya el mAb de captura de IgE antirratón purificado (n.º de cat. 553413, clon R35-72) a 2 µg/ml[a] en tampón de recubrimiento (consulte las soluciones a continuación). Añada 100 ml de una placa ELISA de unión a proteínas mejorada (p. ej., placas ELISA BD Falcon™, BD Labware n.º de cat. 353279). 2. Agite la placa para asegurarse de que todos los pocillos estén cubiertos por la solución de anticuerpo de captura. 3. Cubra la placa e incube durante 1 hora a 37 °C o durante la noche a 4 °C.[b] 4. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween (consulte las soluciones a continuación). Para cada lavado, los pocillos se llenan con 200 µl de PBS/Tween y se dejan reposar antes de aspirar o vaciar. Como paso final, golpee la placa sobre toallas de papel para eliminar el exceso de tampón. II. Bloqueo: 1. Bloquee la placa con 200 µl de tampón de bloqueo (ver soluciones a continuación) por pocillo. 2. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lave la placa tres veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. III. Aplicación de estándares y muestras: 1. Deje la columna 1 como pocillos en blanco (es decir, sin añadir antígeno, solo 100 µl de tampón de bloqueo por pocillo). Utilice las columnas 2 y 3 para el estándar duplicado, 100 µl por pocillo: diluya el estándar de IgE[a] de ratón purificado (n.º de cat. 557079, clon C38-2; o el estándar de IgE[b] de ratón, n.º de cat. 553481 (clon C48-2) en una serie de 8 diluciones dobles, en tampón de bloqueo, comenzando en 0,5 las columnas restantes para añadir muestras a varias diluciones en tampón de bloqueo, 100 µl por pocillo. 2. Cubra la placa e incube durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.[b] 3. Lave la placa 3 veces con PBS/Tween, como en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. IV . Incubación con anticuerpo de detección: 1. Diluya el anti-IgE de ratón biotinilado (n.º de cat. 553419, clon R35-118) para 2 µg/ml[a] en tampón de bloqueo. Añadir 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. 3. Lavar la placa 6 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. V. Añadir peroxidasa de rábano picante con avidina o estreptavidina (Av-HRP o SAv-HRP): 1. Diluir Av-HRP (n.º de cat. 554058) o SAv-HRP (n.º de cat. 554066) 1:1000 en tampón de bloqueo.[c] Añadir 100 µl por pocillo. 2. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 3. Lavar la placa 6 veces con PBS/Tween, como se indica en la Sección I, Paso 4, de este protocolo. VI. Añadir sustrato y desarrollar: 1. Descongelar el tampón de sustrato (ABTS) (ver soluciones (ver abajo) dentro de los 20 minutos posteriores a su uso. Agregar 11 µl de H₂O₂ al 30 % (Sigma, n.° de cat. H1009) a 11 ml y agitar en vórtex. Agregar inmediatamente 100 µl por pocillo y dejar desarrollar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. La coloración se detuvo agregando 50 µl por pocillo de solución de SDS/DMF (ver soluciones abajo) (opcional). 2. Leer la placa a 405 nm. NOTAS a. En la mayoría de los casos, recubrir la placa con mAb primario a 2 µg/ml, 100 µl por pocillo y detectar con el mAb secundario biotinilado a 2 µg/ml, produce una señal muy satisfactoria. Sin embargo, para una señal óptima, los investigadores deben titular cada mAb en un rango de concentraciones (p. ej., 1-8 µg/ml). b. Condiciones de incubación recomendadas para una sensibilidad óptima. c. Estreptavidina/Avidina-HRP El conjugado de otro proveedor puede sustituirse y diluirse según la recomendación del fabricante.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben usarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo contenido de endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.