BD, 557599, BD™ DimerX DimerX I: proteína de fusión CD1d:Ig de ratón dimérica soluble recombinante

Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. La proteína de fusión CD1d:Ig de ratón se expresó junto con β2M de ratón en la línea celular de plasmocitoma de ratón J558L (ATCC TIB-6). Las cadenas polipeptídicas CD1d:Ig y β2M se asocian de forma no covalente como consecuencia de su coexpresión en las células J558L. La proteína de fusión CD1d:Ig se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular mediante cromatografía de afinidad. La pureza de la preparación se confirmó mediante SDS-PAGE. La proteína de fusión CD1d:Ig se analizó mediante ELISA para verificar su identidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Es necesario cargar las porciones CD1d de la proteína dimérica con un antígeno relevante de interés antes de la tinción inmunofluorescente de las células NKT. Los complejos CD1d:Ig se cargan eficazmente mediante la incubación con un exceso de antígenos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (véase el Protocolo 1). Se puede utilizar CD1d:Ig cargado con antígeno para la tinción inmunofluorescente (véase el Protocolo 2). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de antígeno de la proteína dimérica CD1d:Ig Se han descrito varios protocolos de carga de antígeno en la bibliografía. El método recomendado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva de un exceso de antígeno en solución con la proteína CD1d:Ig. Hemos descubierto que la carga pasiva funciona particularmente bien en el caso de antígenos de alta afinidad. Para antígenos de menor afinidad, un aumento en la razón molar de antígeno a proteína dímera puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo basado en resultados para otros productos DimerX de BD Pharmingen. Se sugiere que para cada antígeno, parámetros como la dosis de CD1d:Ig por millón de células, razón molar de antígeno a CD1d:Ig y tiempo de carga del antígeno sean determinados empíricamente por el investigador. Preparación y carga del antígeno: 1. Será necesario determinar el peso molecular (PM) de un antígeno de interés. El PM de α-GalCer es 858 daltons. 2. Mezcle la proteína CD1d:Ig con antígeno específico o de control en un exceso molar (M) de 10, 20 o 40. Se puede utilizar el siguiente cálculo, usando a-GalCer como ejemplo: Dg = Peso molecular del antígeno: p. ej., 858 daltons. DCD1d = Peso molecular de CD1d:Ig = 250.000 daltons. R = razón molar de exceso deseada, p. ej., 40. Mg = microgramos (µg) de antígeno de interés. MCD1d = microgramos (µg) de CD1d:Ig en la reacción. Una cantidad típica de CD1d:Ig con carga de antígeno para la tinción por citometría de flujo es de 0,25 a 4 µg/millón de células (prueba). Mg = MCD1d x R x Dg = 4 µg x 40 x 858 d = 0,55 µg de DCD1d 250.000 d Por lo tanto, se añadirían 0,55 µg de antígeno y 4 µg de CD1d:Ig en solución para una carga de antígeno óptima de CD1d:Ig. 3. Mezcle el antígeno y CD1d:Ig en PBS a pH 7,2 e incube a 37 °C durante la noche. El CD1d:Ig con antígeno puede conservarse a 4 °C hasta una semana. Protocolo 2: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Prepare la mezcla de tinción de la proteína CD1d:Ig con péptidos mezclando 0,25-4 µg de proteína/prueba CD1d:Ig con péptidos con 0,25-4 µg de mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083)/prueba en una proporción de 1:1 o 1:2 de dímero:A85-1. Incube la mezcla durante 60 minutos a temperatura ambiente y protéjala de la luz. 2. Añadir 0,25-4 µg de mAb A111-3 de control de isotipo IgG1 de ratón purificado (n.° de cat. 553485)/prueba a la mezcla de tinción (véase el paso 1 anterior). Incubar la mezcla de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente y proteger de la luz. 3. Resuspender las células de ratón en el tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN₃ o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.° de cat. 554656], que contenga la cantidad adecuada de mAb 2.4G2 anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ (n.° de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10 e⁻¹ células por 50 µl. Incubar 10 minutos a 4 °C. Añadir ~1 x 10e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™ Cat. No. 352008). 4. Añadir 50 µl de tampón FACS que contenga la cantidad óptima por prueba del cóctel de tinción a cada muestra, más cualquier otro anticuerpo específico del marcador de superficie celular que se vaya a utilizar. 5. Lavar las células 2x con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo apropiado para el citómetro de flujo. Protocolo 3: Alternativa: Tinción inmunofluorescente Protocolo 1. Resuspender las células de ratón en tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1% FCS, 0,09% NaN3 o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), Cat. N.º 554656], que contiene la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142), a una concentración aproximada de 10 e6 células por 50 µl. Incubar durante 10 minutos a 4 °C. Añadir aproximadamente 1 x 10 e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™, n.º de cat. 352008). 2. Añadir de 0,25 a 4 µg de proteína CD1d:Ig cargada con antígeno a la suspensión celular. Incubar durante 60 minutos a 4 °C. 3. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y aspirar el sobrenadante. 4. Resuspender las células en 100 µl de tampón FACS con reactivo secundario fluorescente adecuadamente diluido. Normalmente utilizamos el mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.° de cat. 550083). Incubar de 30 a 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo. *Los derechos de α-GalCer pertenecen a Kirin Brewery. La molécula de α-GalCer y sus derivados están protegidos por la patente estadounidense n.° 5.936.076. No se otorga ninguna licencia implícita para el uso de α-GalCer.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.