BD, 557630, BD™ ELISPOT HRP Estreptavidina para ELISPOT

Aplicación: ELISPOT (probado rutinariamente)
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ProClin™ 150 como conservante.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: La estreptavidina se conjugó con la enzima en condiciones óptimas. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Protocolo ELISPOT estándar. Tampones, medios y otros reactivos para ensayos ELISPOT. Tampón de recubrimiento: Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS): 8 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1,44 g de Na₂HPO₃•7H₂O; 0,24 g de KH₂PO₃; añadir dH₂O a 1 litro. Ajustar el pH a 7,2, esterilizar en autoclave o con un filtro estéril (0,2 μm de poro) y almacenar a 4 °C. Medio de cultivo tisular completo. Un medio compuesto por RPMI 1640 (Bio-Whittaker, n.º de cat. 12-167Q) u otro medio adecuado que contenga un 10 % de FBS inactivado por calor, un 1 % de penicilina-estreptomicina-L-glutamina (Gibco-BRL, n.º de cat. 10378-016) y 5 × 10⁻¹ M de 2-mercaptoetanol se utiliza a menudo para el cultivo de células humanas, de primates no humanos y de roedores. PBS-Tween®: PBS con un 0,05 % de Tween®-20 (Sigma, P-1379; 0,5 ml de Tween®-20 por 1 L de PBS). Tampón de dilución: PBS con un 10 % de FBS. Solución de sustrato: utilice el conjunto de sustrato BD™ ELISPOT AEC (n.º de cat. 551951) de BD Biosciences para mayor comodidad. Protocolo 1. Anticuerpo de recubrimiento: a. Diluya el anticuerpo de captura a la concentración recomendada con tampón de recubrimiento. Añada 100 μl de solución de anticuerpo diluida a cada pocillo de una placa ELISPOT. b. Vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT y almacene las placas a 4 °C durante la noche. 2. Bloqueo: a. Deseche el anticuerpo de recubrimiento. Lave los pocillos 1 vez con 200 μl/pocillo de medio de cultivo tisular completo que contenga suero fetal bovino al 10 %. b. Añada 200 μl/pocillo de medio de cultivo tisular completo; vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT y deje bloquear durante 2 horas a temperatura ambiente. 3. Activación celular: los protocolos de activación específicos, incluidas las concentraciones celulares y los tiempos de incubación, variarán en función del tipo de célula, la elección del estímulo y el analito diana de interés. a. Deseche el medio de cultivo tisular completo. b. Prepare mitógeno, antígeno u otro agente biológico diluido en medio de cultivo tisular completo para tratar las células. Agregue 100 μl/pocillo a la placa ELISPOT. c. Prepare suspensiones celulares a diferentes densidades (p. ej., de 1 × 10^5 células/ml a 2 × 10^6 células/ml). Tenga en cuenta que se deben preparar controles negativos apropiados agregando células a los pocillos sin un agente de tratamiento particular y estableciendo pocillos de fondo sin células (es decir, pocillos que solo reciben el medio de cultivo tisular completo). Las titulaciones celulares se pueden realizar en otra placa de cultivo celular o en tubos y luego transferir a los micropocillos de la placa ELISPOT o realizarse directamente en la placa ELISPOT. Se debe tener cuidado de no tocar ni dañar la superficie recubierta de los micropocillos. Las células se deben agregar en volúmenes de 100 μl a los micropocillos de la placa ELISPOT. d. Después de agregar las células, vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT e incube la placa a 37 °C, 5 % de CO2 y 99 % de humedad. La duración del tiempo de incubación variará dependiendo del agente utilizado para tratar las células para que secreten (o no secreten) el analito de interés (p. ej., los cultivos generalmente se establecen durante 2-48 h). 4. Anticuerpo de detección: a. Aspire las suspensiones de células cultivadas de los micropocillos de la placa ELISPOT. Después del paso 3, no se requieren condiciones asépticas. Lave y remoje los pocillos 2 veces con 200 μl/pocillo de agua destilada (dH2O). Deje que los pocillos se remojen durante 3-4 min en cada paso de lavado. b. Lave los pocillos 3 veces con 200 μl de PBS-Tween® por pocillo. Deseche el tampón de lavado. c. Diluya el anticuerpo de detección biotinilado en el tampón de dilución. Agregue 100 μl por pocillo. d. Vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 5. Estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (estreptavidina-HRP) [N.º de cat. 557630]: a. Desechar la solución de anticuerpos de detección. Lavar los pocillos 3 veces con 200 μl/pocillo de PBS-Tween®. Dejar los pocillos en remojo durante 1-2 minutos en cada paso de lavado. b. Diluir la estreptavidina-HRP en tampón de dilución. Añadir 100 μl de estreptavidina HRP diluida por pocillo. c. Vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT; incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 6. Sustrato: a. Desechar la solución de estreptavidina HRP. Lavar los pocillos 4 veces con 200 μl de PBS-Tween® por pocillo. Dejar los pocillos en remojo durante 1-2 minutos en cada paso de lavado. b. Lave y remoje los pocillos 2 veces con 200 μl de PBS por pocillo. c. Añada 100 μl de solución de sustrato AEC preparada con el juego de sustrato BD™ ELISPOT AEC (n.º de cat. 551951) a cada pocillo. Vigile el desarrollo de las manchas a temperatura ambiente de 5 a 60 min. No permita que el color se desarrolle demasiado. Esto provocará un fondo alto. d. Detenga la reacción del sustrato enjuagando bien los pocillos con H₂O desmineralizada. e. Seque la placa al aire durante 2 h o durante la noche en la oscuridad hasta que esté completamente seca. Retirar la bandeja de plástico debajo de la placa de 96 pocillos facilita el secado. Guarde la placa en una bolsa de plástico sellada, en la oscuridad, antes del análisis. f. Enumere las manchas marrones manualmente mediante inspección con un microscopio de disección (o una lupa fija) o automáticamente utilizando un analizador ELISPOT y su software. Advertencia: La estreptavidina-HRP (componente 51-9000209) contiene un 0,004 % de una mezcla de CMIT/MIT (3:1), que es una mezcla de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [n.º CE 247-500-7] y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona [n.º CE 220-239-6] (3:1). Indicaciones de peligro Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Consejos de precaución Evitar respirar el polvo/el humo/el gas/la niebla/los vapores/el aerosol. Llevar guantes/ropa/protección ocular/protección facial de protección. La ropa de trabajo contaminada no debe sacarse del lugar de trabajo. En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Eliminar el contenido/el recipiente de conformidad con la normativa local/regional/nacional/internacional.
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Ingrediente peligroso: ProClin™ 150. Evite la exposición a la piel y los ojos, así como su ingestión. Lave la piel expuesta con agua y jabón. Enjuague los ojos con agua. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company. Para conocer las patentes estadounidenses aplicables, consulte bd.com/patents.