BD, 557899, Partículas magnéticas anti-R-ficoeritrina (PE) BD IMag™ - DM

Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: R-ficoeritrina
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
ID de registro: AB_398634
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROTOCOLO DE SEPARACIÓN Y ETIQUETADO MAGNÉTICO 1. Prepare los siguientes tampones y colóquelos en hielo: a. Tampón de tinción celular: solución salina tamponada con fosfato, suero fetal bovino inactivado por calor al 3%, azida sódica al 0,1%. b. Tampón BD IMag™ 1X: diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o, como alternativa, prepare solución salina tamponada con fosfato, suplementada con BSA al 0,5%, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1%.* 2. Prepare una suspensión de células individuales del tejido linfoide de interés o prepare PBMC a partir de sangre anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando la solución Ficoll-Hypaque™ de densidad adecuada. Elimine los grupos de células o los residuos pasando las células suspendidas por un colador de nailon de 70 µm. 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular a una concentración de 2 x 10e7 células/ml. 4. Opcional: si corresponde, añada BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (n.º de cat. 553141) o BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 (n.º de cat. 550270) a 0,25 µg/10e6 células e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Añada el anticuerpo conjugado con PE (o cóctel de anticuerpos) a la concentración adecuada e incube en hielo durante 15 minutos. † 6. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X y aspire con cuidado TODO el sobrenadante. Para las depleciones, proceda al Paso 7. Para las selecciones positivas, proceda al Paso 18. Depleciones: 7. Agite bien las Partículas Magnéticas Anti-R-Ficoeritrina (PE) - DM y agregue 50 µl de partículas por cada 1x10e7 células totales. 8. MEZCLE COMPLETAMENTE. Incube los leucocitos de ratón/rata durante 30 minutos a 6 °C-12 °C y las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos. † 9. Lleve el volumen de marcaje hasta una concentración de 2-8 x 10e7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X o medio de cultivo.* 10. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo agregado no debe exceder 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el Imán de Separación Celular (posición horizontal) durante 6-8 minutos. - Para un mayor volumen, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, cuyo volumen máximo añadido no debe exceder los 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 11. Con el tubo en el imán de separación celular, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para aspirar el sobrenadante (fracción agotada) en un tubo nuevo. 12. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y añada tampón BD IMag™ 1X (o medio) al mismo volumen que en el paso 9. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocarlo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 13. Utilizando una pipeta Pasteur nueva, aspire cuidadosamente el sobrenadante y combínelo con la fracción agotada del paso 11 anterior. 14. Repita los pasos 12 y 13. La fracción deplecionada combinada contiene células sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más siguiendo el paso 16. 15. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo. 16. Para aumentar la pureza de la fracción deplecionada combinada, coloque el tubo en el imán de separación celular durante 6-8 minutos adicionales. - Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 17. Aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción deplecionada final) en un tubo nuevo. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. Selecciones positivas: 18. Agite bien las Partículas Magnéticas Anti-R-Ficoeritrina (PE) - DM y añada de 10 a 50 µl de partículas por cada 1 x 10e7 células totales. Nota: La cantidad de partículas a añadir puede variar según la cantidad de células objetivo y la densidad de la superficie celular del antígeno. Consulte la Tabla 1 para ver algunos ejemplos comunes. 19. MEZCLE COMPLETAMENTE. Incube los leucocitos de ratón/rata durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C y las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos. † 20. Lleve el volumen de marcaje a una concentración de 2 a 8 x 10e7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 21. Coloque inmediatamente el tubo sobre el Imán de Separación Celular e incube de 6 a 8 minutos. 22. Con el tubo sobre el Imán de Separación Celular, aspire con cuidado el sobrenadante. Este sobrenadante es la fracción negativa. 23. Retire el tubo del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 20. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y regrese el tubo al imán de separación celular durante otros 2-4 minutos. 24. Con el tubo en el imán de separación celular, retire con cuidado el sobrenadante. 25. Repita los pasos 23 y 24. 26. Después del paso de lavado final, retire el tubo del imán de separación celular. Resuspenda la fracción positiva en un tampón o medio de cultivo apropiado y proceda con la(s) aplicación(es) posterior(es) deseada(s), incluida la citometría de flujo. NOTAS: * Para el agotamiento de leucocitos de ratón, el medio de cultivo tisular generalmente produce un ligero aumento en la viabilidad y la recuperación, en comparación con el tampón IMag, sin reducir la pureza celular. Debido a que las aplicaciones pueden variar, se anima a los investigadores a realizar una comparación de prueba de los medios de cultivo y el tampón IMag para demostrar que no hay efectos adversos. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.