BD, 557932, Partículas magnéticas BD IMag™ APC - DM

Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
ID de registro: AB_398637
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de Ensayo Recomendados: A continuación, se presenta un protocolo detallado de Marcaje y Separación Magnética. En resumen, las células se marcan con el anticuerpo conjugado con APC, que reconoce la subpoblación de interés. Tras eliminar el exceso de anticuerpo, se añaden BD IMag™ Anti-APC Particles - DM a la suspensión celular, que une el anticuerpo conjugado con APC a las células. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca dentro del campo magnético del Imán de Separación Celular. A continuación, se realiza la selección positiva o depleción. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan ser extraídas (fracción deplecionada o negativa). A continuación, se retira el tubo del campo magnético para resuspender la fracción positiva. Las selecciones se repiten dos veces para aumentar la pureza de la fracción positiva y el rendimiento de la fracción deplecionada. Los pasos de la separación magnética se detallan en los diagramas de flujo de depleción y selección positiva adjuntos. El pequeño tamaño de las partículas BD IMag™ permite que la fracción positiva se evalúe aún más en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo. ETIQUETADO MAGNÉTICO Y PROTOCOLO DE SEPARACIÓN 1. Prepare los tampones y colóquelos en hielo. a. Tampón de tinción celular: solución salina tamponada con fosfato, suero fetal bovino inactivado por calor al 3%, azida sódica al 0,1%. b. Tampón BD IMag™ 1X: diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato, suplementada con BSA al 0,5%, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1%.* 2. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales del tejido linfoide de interés o prepare PBMC a partir de sangre anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando la solución Ficoll-Paque de densidad adecuada. Elimine los grumos de células o los restos pasando las células suspendidas por un colador de nailon de 70 µm. 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular a una concentración de 2 × 10e7 células/ml. 4. Opcional: si es necesario, añada BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142) o BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 mAb D34-485 (n.º de cat. 550270/550271) a 0,25 µg/10e6 células e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Añada el anticuerpo conjugado con APC (o la mezcla de anticuerpos conjugados con APC) a la concentración adecuada e incube en hielo durante 15 minutos. ** 6. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. Para las depleciones, continúe con el paso 7. Para las selecciones positivas, continúe con el paso 18. Depleciones: 7. Agite bien las partículas anti-APC BD IMag™ - DM y añada 50 µl de partículas por cada 1 × 10⁻¹ células totales. 8. Mezcle bien. Refrigere durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. 9. Aumente el volumen de marcado a una concentración de 2 a 8 × 10⁻¹ células/ml con tampón BD IMag™ 1X o medio de cultivo.* 10. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 × 75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un mayor volumen, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 × 100 mm, el volumen máximo agregado no debe exceder los 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 11. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción agotada) y colóquelo en un tubo nuevo. 12. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue 1X tampón BD IMag™ (o medio) al mismo volumen que en el paso 9. Resuspenda el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocarlo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Tubo de 17 × 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 13. Con una pipeta Pasteur nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción agotada del paso 11 anterior. 14. Repita los pasos 12 y 13. La fracción agotada combinada contiene células sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores o se pueden enriquecer aún más siguiendo el paso 16. 15. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo. 16. Para aumentar la pureza de la fracción agotada combinada, coloque el tubo en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Tubo de 17 × 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 17. Aspire con cuidado el sobrenadante y colóquelo en un tubo nuevo. Esta es la fracción agotada final. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. Selecciones positivas: 18. Agite bien las partículas anti-APC BD IMag™ - DM y añada de 10 a 50 µl de partículas por cada 1 × 10e7 células totales. La cantidad de partículas a añadir variará en función de la cantidad de células objetivo y de la densidad de la superficie celular del antígeno. Consulte la tabla a continuación para ver algunos ejemplos comunes. 19. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigere los leucocitos de ratón o rata durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. Incube las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos. 20. Aumente el volumen de marcaje de 2 a 8 × 10e7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 21. Coloque inmediatamente el tubo sobre el imán de separación celular e incube de 6 a 8 minutos. 22. Con el tubo en el imán de separación celular, aspire con cuidado el sobrenadante. Este sobrenadante se considera la fracción negativa. 23. Retire el tubo del imán de separación celular y añada tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 20. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 2 a 4 minutos más. 24. Con el tubo en el imán de separación celular, retire con cuidado el sobrenadante. 25. Repita los pasos 23 y 24. 26. Tras el último lavado, retire el tubo del imán de separación celular. Resuspenda la fracción positiva en un tampón o medio de cultivo adecuado y proceda con las aplicaciones posteriores deseadas, incluida la citometría de flujo. NOTAS: * Para la depleción de leucocitos de ratón, el medio de cultivo tisular suele producir un ligero aumento de la viabilidad y la recuperación, en comparación con el tampón IMag, sin reducir la pureza celular. Recomendamos que los investigadores realicen una comparación de prueba del medio con el tampón para asegurarse de que no haya efectos adversos. ** Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este reactivo conjugado con APC puede utilizarse en cualquier citómetro de flujo equipado con láser de colorante, HeNe o diodo rojo. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.