BD, 557982, Par de ELISPOT de IL-10 de ratón BD™ ELISPOT

Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869114
Descripción: Descripción El ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISPOT) es una herramienta potente para detectar y enumerar células individuales que secretan una proteína particular in vitro. Basado en el ELISA sándwich, el ensayo ELISPOT deriva su especificidad y sensibilidad mediante el empleo de anticuerpos de captura y detección de alta afinidad y amplificación enzimática. Aunque originalmente desarrollado para analizar células secretoras de anticuerpos específicos, el ensayo ha sido adaptado para medir las frecuencias de células que producen y secretan otras moléculas efectoras, como las citocinas. La sensibilidad del ensayo se presta a la medición incluso de frecuencias muy bajas de células productoras de citocinas (p. ej., 1/300 000). Las fortalezas únicas del ensayo incluyen alta sensibilidad, alto rendimiento, análisis de alto contenido, volumen mínimo de material biológico requerido, aplicabilidad a muestras biológicas congeladas/descongeladas y compatibilidad con otros ensayos. Por ejemplo, las células analizadas por ELISPOT pueden transferirse para clonación, ensayos de proliferación, citometría de flujo u otros métodos de análisis. Este producto contiene reactivos suficientes para cinco placas de 96 pocillos, incluido un anticuerpo de captura de citocinas sin marcar (sin formato de azida/bajo endotoxina), un anticuerpo de detección de citocinas biotinilado y un certificado de análisis que proporciona concentraciones óptimas de reactivos específicos del lote.
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: REACTIVOS ADICIONALES REQUERIDOS A. Se recomienda BD™ ELISPOT Streptavidin-Heradish Peroxidase (n.° de cat. 557630). B. Tampón de recubrimiento (solución salina tamponada con fosfato [PBS] 1X): 8 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1,44 g de Na₂HPO₄·7H₂O, 0,24 g de KH₂PO₄; disuelto en H₂O hasta un volumen final de 1 litro. Ajuste el pH a 7,2, filtre estérilmente (filtro de poro de 0,2 µm) y almacene a 4 °C. C. Solución de bloqueo: medio de cultivo tisular completo (p. ej., RPMI 1640 con 10 % de suero fetal bovino [FBS] y 1 % de penicilina-estreptomicina-L-glutamina [Gibco-BRL n.º 10378-016]). D. Tampón de lavado I: PBS 1X con 0,05 % de Tween-20 (0,5 mL de Tween-20 por 1 L de PBS). E. Tampón de lavado II: PBS 1X. F. Tampón de dilución: PBS 1X con 10 % de FBS. G. Se recomienda el conjunto de sustrato BD™ ELISPOT AEC (n.º de cat. 551951). Alternativamente, prepare de la siguiente manera: 1. Prepare la solución madre de AEC (3-amino-9-etil-carbazol; Sigma A-5754): mezcle 100 mg de AEC en 10 mL de DMF (N,N-dimetilformamida; Sigma D-4551). Precaución: dispense DMF en una campana extractora. Guarde la solución en un recipiente de vidrio. 2. Prepare la solución de acetato 0,1 M: añada 148 mL de ácido acético/ácido glacial 0,2 M a 352 mL de acetato de sodio 0,2 M. Ajuste el volumen a 1 L de agua desionizada; ajuste el pH a 5,0. 3. Para la solución de sustrato final, añada 333,3 µL de solución madre de AEC a 10 mL de solución de acetato 0,1 M. Filtre a través de un filtro de 0,45 µm. Añada 5 µL de H₂O₂ (30%) y úsela inmediatamente. NOTA SOBRE EL PROTOCOLO ELISPOT: Use las placas ELISPOT y los reactivos en condiciones asépticas (p. ej., usando una campana de flujo laminar o una cabina de bioseguridad) para los pasos 1 a 7. Las soluciones marcadas con un asterisco (*) no están incluidas y se describen en la sección Reactivos adicionales requeridos. Anticuerpo de recubrimiento 1. Diluya el anticuerpo de captura en tampón de recubrimiento* (consulte el Certificado de análisis para obtener información sobre la dilución del anticuerpo). Agregue 100 µl de solución de anticuerpo diluida a cada pocillo de una placa ELISPOT; se recomienda la placa Millipore, n.º de cat. S2EM004M99. 2. Guarde las placas a 4 ºC durante la noche con la tapa. Bloqueo 3. Deseche el anticuerpo de recubrimiento. Lave los pocillos 1 vez con 200 µl/pocillo de solución de bloqueo*. 4. Agregue 200 µl/pocillo de solución de bloqueo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. Activación celular 5. Deseche la solución de bloqueo. Prepare el mitógeno o antígeno, diluido en medio de cultivo tisular completo (p. ej., RPMI 1640 con FBS, Pen/Strep y L-glutamina). Agregue 100 µL/pocillo a la placa ELISPOT. 6. Prepare suspensiones celulares a diferentes densidades (p. ej., 1 X 10e5/mL - 2 X 10e6 células/mL). Agregue 100 µL/pocillo de cada suspensión celular a los pocillos de la placa ELISPOT. 7. Vuelva a colocar la tapa de la placa ELISPOT. Incube la placa ELISPOT a 37 °C, 5 % de CO2 y 99 % de humedad. La duración del tiempo de incubación puede variar (p. ej., 2 h - 24 h) dependiendo de la naturaleza del sistema de cultivo celular estimulador. Las condiciones de activación específicas y los tiempos de incubación variarán, dependiendo del tipo de célula, la cinética y la citocina de interés. Consulte el Certificado de análisis proporcionado con cada par ELISPOT para conocer las condiciones de ensayo de los controles positivos sugeridos. Nota: Después del paso 7, ya no se necesitan condiciones asépticas. Anticuerpo de detección 8. Aspire la suspensión celular. Lave los pocillos 2 veces con agua desionizada (DI). Deje que los pocillos se remojen durante 3-5 minutos en cada paso de lavado. 9. Lave los pocillos 3 veces con 200 µL/pocillo de tampón de lavado I*. Deseche el tampón de lavado. 10. Diluya el anticuerpo de detección en tampón de dilución* (consulte el Certificado de análisis para obtener información sobre la dilución del anticuerpo). Agregue 100 µL por pocillo. 11. Vuelva a colocar la tapa e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. Enzima 12. Deseche la solución de anticuerpo de detección. Lave los pocillos 3 veces con 200 µL/pocillo de tampón de lavado I*. 13. Diluya estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP)* en tampón de dilución. (Se recomienda BD™ ELISPOT Streptavidin-HRP, n.º de cat. 557630). Añada 100 µL de Streptavidin-HRP diluido por pocillo. 14. Vuelva a colocar la tapa; incube durante 1 h a temperatura ambiente. Sustrato 15. Descarte la solución de Streptavidin-HRP. Lave los pocillos 4 veces con 200 µL de tampón de lavado I* por pocillo. 16. Lave los pocillos 2 veces con 200 µL de tampón de lavado II* por pocillo. 17. Añada 100 µL de solución de sustrato final (AEC)* a cada pocillo. Controle el desarrollo de las manchas entre 5 y 60 min. 18. Detenga la reacción del sustrato lavando los pocillos con agua desionizada. 19. Seque la placa al aire durante 2 h o toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad, hasta que esté completamente seca. Conserve la placa en la oscuridad antes del análisis. 20. Enumere los puntos manualmente utilizando un microscopio de disección o automáticamente utilizando un analizador ELISPOT.
Avisos del producto: Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/A : nulo : N/A : N/A