BD, 558007, Kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos BD IMag™ - DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869116
Descripción: Descripción El kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de linfocitos B de sangre periférica. El cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos biotinilados contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos, plaquetas y leucocitos periféricos, pero no en linfocitos B. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son partículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de linfocitos B humanos BD IMag™ - DM evita la activación accidental de linfocitos B enriquecidos mediante reactivos que no se unen directamente a ellos. Este kit de enriquecimiento se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos biotinilados consta de los siguientes anticuerpos: Anti-CD3 humano, clon UCHT1 Anti-CD41a humano, clon HIP8 Anti-CD43 humano, clon L60 Anti-CD235a humano, clon GA-R2
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados En resumen, el cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos biotinilados, cuando se agrega a la muestra, teñirá simultáneamente eritrocitos, plaquetas y la mayoría de los leucocitos, pero no los linfocitos B. Después de lavar cualquier exceso de anticuerpo que no se haya unido a las células durante la tinción, se agregan BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular y se unirán a los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca dentro del campo magnético del imán de separación celular BD IMag™. Luego se realiza una selección negativa para enriquecer los linfocitos B no marcados. Las células marcadas con estreptavidina migrarán hacia el imán (designada como la fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (designada como la fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere mayor pureza, se pueden realizar rondas de selección negativa adicionales en la fracción enriquecida. El procedimiento de separación magnética descrito se representa gráficamente en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos biotinilados se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de linfocitos B a partir de PBMC. PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO Y MARCAJE MAGNÉTICO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™.* 3. Elimine los grumos de células o residuos pasando la suspensión a través de un filtro de nailon de 70 µm. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 10 x 10^6 células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de linfocitos B humanos biotinilados a razón de 5 µl por cada 1 x 10^6 células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X 10 veces superior, centrifugue a 300 × g durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 6. Agite bien el BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 1 x 10^6 células totales. 7. MEZCLE COMPLETAMENTE. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Lleve el volumen de marcaje a una concentración de 20-80 x 10^6 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un volumen mayor, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda la fracción positiva pipeteando de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Usando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene linfocitos B sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más procediendo al Paso 15. 14. Las células de fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 15. OPCIONAL: Si el donante tiene una baja frecuencia de linfocitos B, la pureza de la fracción enriquecida combinada puede aumentarse en otro 2-8% (compare los paneles inferior medio e inferior derecho en la figura) colocando el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 16. Aspire con cuidado el sobrenadante (fracción dos veces enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril para la aplicación posterior. 17. Analice muestras de la suspensión celular total, fracciones positivas y enriquecidas para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular NOTAS: * Consejos para una preparación celular exitosa: o Extraiga sangre en un tubo que contenga EDTA o Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. o Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. o Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y proceda al paso 3. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D