BD, 558315, Conjunto ELISA BD OptEIA™ para C5b-9 humano

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869153
Descripción: Descripción El OptEIA™ Set para C5b-9 humano contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para C5b-9 natural en suero, plasma y otras muestras biológicas. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 5 placas de 96 pocillos si se siguen el almacenamiento, los materiales, la preparación del tampón y el procedimiento de ensayo recomendados según lo especificado en este paquete. Estandarización: Este inmunoensayo está calibrado contra suero humano purificado activado con factor de veneno de cobra. Optimización del ensayo Los conjuntos BD OptEIA permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo).
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD OptEIA (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone (n.° de cat. SH30088, inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato BD OptEIA TMB (n.° de cat. 555214). 5. Solución de parada: 1 M H3PO4 o 2 N H2SO4 Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta, un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco lavador o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción automática de datos 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: retire cualquier material particulado mediante centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y permita que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: recolecte el plasma usando EDTA como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. También se puede usar citrato o heparina como anticoagulante si es necesario. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra el vial con cuidado para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con la cantidad apropiada de diluyente de ensayo para obtener un estándar madre de 30 ng/mL. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Agite suavemente con vórtex para mezclar. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Usar el estándar reconstituido inmediatamente. Usar un vial de estándar por cada placa de 96 pocillos. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Preparar 30 ng/mL de estándar madre como se indica en el punto 1. Reconstitución. Mezclar suavemente con vórtex. b. Añadir 300 μL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquetar como 15 ng/mL, 7,5 ng/mL, 3,75 ng/mL, 1,875 ng/mL, 0,938 ng/mL y 0,469 ng/mL. Preparación del detector de trabajo: 1. Determinar el volumen necesario para el experimento: 100 μL por pocillo. 2. Determinar la cantidad de anticuerpo detector 250X y estreptavidina-HRP 250X para añadir a la mezcla del detector de trabajo. 3. Añada volúmenes apropiados de anticuerpo detector 250X y 250X Streptavidin-HRP al diluyente de ensayo para preparar el volumen requerido de detector de trabajo. No diluya más anticuerpo de detección del que necesita para su experimento. 4. Añada el detector de trabajo a cada pocillo como se describe en el procedimiento de ensayo. Nota: El detector de trabajo debe prepararse dentro de los 15 minutos anteriores a su uso. Procedimiento de ensayo detallado 1. Diluya el anticuerpo de captura 1:250 en tampón de recubrimiento y cubra los micropocillos con 100 µL de anticuerpo de captura diluido por pocillo. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. No diluya más anticuerpo de captura del que necesita para su experimento. 2. Aspire los pocillos y lave 3 veces con ≥ 300 µL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 µL/pocillo de diluyente de ensayo. Incubar a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora. 4. Aspirar/lavar como en el paso 2. 5. Preparar las diluciones del estándar y de la muestra en el diluyente de ensayo. Ver "Preparación y manipulación de estándares". Anotar la concentración del estándar reconstituido para futuras consultas. 6. Pipetear 100 μL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Sellar la placa e incubar durante 2 horas a TA. 7. Aspirar/lavar como en el paso 2, pero con 3 lavados en total. 8. Añadir 100 μL de detector de trabajo a cada pocillo. Sellar la placa e incubar durante 1 hora a TA. 9. Aspirar/lavar como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. 10. Añadir 100 μL de solución de sustrato TMB a cada pocillo. Incubar la placa (sin sellador) durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 11. Añada 50 μL de solución de parada a cada pocillo. 12. Lea la absorbancia a 450 nm en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Si dispone de corrección de longitud de onda, reste la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añada 100 μL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire y lave 3 veces. 3. Bloquee las placas: 200 μL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incube 1 h a temperatura ambiente. 4. Aspire y lave 3 veces. 5. Añada 100 μL de estándar o muestra a cada pocillo. Incube 2 h a temperatura ambiente. 6. Aspire y lave 3 veces. 7. Añada 100 μL de detector de trabajo diluido a cada pocillo. Incube 1 h a temperatura ambiente. 8. Aspire y lave 7 veces. 9. Agregue 100 μL de solución de sustrato TMB a cada pocillo. Incube 30 min RT en oscuridad. 10. Agregue 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Lea a 450 nm dentro de los 30 min con corrección λ de 570 nm. Cálculo de resultados Calcule la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Reste la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Dibuje la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de C5b-9 en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibuje la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de C5b-9 de las incógnitas, encuentre el valor de absorbancia media de la incógnita en el eje y y dibuje una línea horizontal hacia la curva estándar. En el punto de intersección, dibuje una línea vertical hacia el eje x y lea la concentración de C5b-9. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de C5b-9 por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos de computadora, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se probaron en el ensayo BD OptEIA a ≥ 5 μg/mL y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 470 pg/mL). C3, C4, C5, C6, C7, C8 y C9 humanos nativos purificados Limitaciones del procedimiento · Las muestras que generan valores de absorbancia superiores a la curva estándar se deben diluir con diluyente estándar y volver a analizar. · No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. · Los sets BD OptEIA están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes de sets. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/A : nulo : N/A : N/A