BD, 558451, Kit de enriquecimiento de células progenitoras hematopoyéticas (madre) de ratón BD IMag™ - DM

Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869178
Descripción: El kit de enriquecimiento de células progenitoras hematopoyéticas de ratón BD IMag™ - DM reacciona con células de los principales linajes hematopoyéticos, como linfocitos T, linfocitos B, monocitos/macrófagos, granulocitos y eritrocitos. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas con estreptavidina conjugada covalentemente en sus superficies. Este kit está diseñado para el enriquecimiento inmunomagnético de progenitores hematopoyéticos de médula ósea de ratón mediante la depleción de células de los linajes linfocítico T y B, mieloide (monocítico y granulocítico) y eritroide. El kit contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 células de médula ósea. El cóctel de depleción de linaje de ratón con biotina se compone de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-CD3e de ratón, clon 145-2C11 Anti-CD11 de ratón, clon M1/70 Anti-CD45R/B220 de ratón, clon RA3-6B2 Anti-Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) de ratón, clon RB6-8C5 Anti-TER-119 de ratón/células eritroides, clon TER-119
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de marcaje magnético y depleción. En resumen, el cóctel de depleción de linaje de ratón biotinilado tiñe simultáneamente las células hematopoyéticas comprometidas con el linaje según sus diferentes especificidades. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las células progenitoras hematopoyéticas no comprometidas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción depletada). Se realizan selecciones negativas adicionales para optimizar el rendimiento y la pureza de la fracción depletada. Los pasos de la separación magnética se detallan en el diagrama de flujo de depleción. Tanto las fracciones positivas como las deplecionadas pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo tisular. Los anticuerpos del cóctel de depleción de linaje murino biotinilado se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos de médula ósea. PROTOCOLO DE MARCAJE MAGNÉTICO Y DEPLECIÓN 1. Prepare soluciones tampón estériles y colóquelas en hielo. a. Solución tampón de tinción celular: Solución salina tamponada con fosfato suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 3 % y azida sódica al 0,1 %. b. Solución tampón BD IMag™ 1X: Diluya la solución tampón BD IMag™ (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales de médula ósea de ratón. Retire los grumos de células o restos pasando las células suspendidas por un filtro de nailon de 70 µm. Nota: Los fémures y las tibias de un ratón adulto suelen producir de 20 a 60 x 10^6 células hematopoyéticas. Un ratón producirá aproximadamente de 0,3 a 1,0 x 10^6 células de linaje negativo. 3. Cuente las células y resuspéndalas en un tampón de tinción celular estéril a una concentración de 10 a 20 x 10^6 células/ml. Aparte una muestra de células sin teñir (~5 x 10^6 células) para usar en el análisis de citometría de flujo en el paso 17. 4. Añada el anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón purificado Mouse BD Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142) a 0,25 µg/10^6 células e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Añada el cóctel de depleción de linaje de ratón biotinilado a 5 µl por 1 x 106 células e incube en hielo durante 15 minutos. 6. Lave las células marcadas con un exceso de volumen 10X de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 xg durante 7 minutos y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. 7. Agite bien el BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 1 x 10^6 células totales. 8. Mezcle bien. Refrigere durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. 9. Aumente el volumen de marcaje a 20-80 x 10^6 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 10. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 8 minutos. Para un volumen mayor, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición vertical) durante 10 minutos. 11. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción agotada) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 12. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 9. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 8 minutos. -Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 10 minutos. 13. Usando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción agotada del paso 11 anterior. 14. Las células de fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 15. Coloque el tubo que contiene la fracción deplecionada combinada en el imán de separación celular durante 8 minutos finales. -Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 10 minutos. 16. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción deplecionada final que contiene progenitores hematopoyéticos enriquecidos. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 17. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones deplecionadas positiva y final deben analizarse por citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: -Después de lavar el exceso de anticuerpo biotinilado, aspire completamente el sobrenadante. El sobrenadante que queda en el tubo aumentará el volumen de marcado, lo que disminuirá la eficiencia del marcado magnético. -Al marcar células con BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM, use solo tampón sin biotina. La biotina libre competirá con el anticuerpo biotinilado para unirse a las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM. -Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D