BD, 558521, BD IMag™ Conjunto de enriquecimiento de células T CD4 humanas ingenuas - DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869213
Descripción: El kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas naïve BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de células T CD4+ naïve intactas de sangre periférica. El kit de enriquecimiento de células T CD4+ naïve humanas naïve contiene anticuerpos monoclonales biotinilados que reconocen antígenos expresados ​​en células T de memoria, células T CD8+, células B, células NK, células T γ/δ, monocitos, células dendríticas (CD), granulocitos, plaquetas y células eritroides. Las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, este kit de enriquecimiento evita la activación accidental de las células T auxiliares naïve enriquecidas mediante el uso de reactivos que no se unen directamente a dichas células T. Este producto ha sido optimizado para su uso con el imán de separación de células BD IMag™ (n.° de cat. 552311) y contiene suficientes reactivos para marcar 1× 10E9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas ingenuas comprende los siguientes anticuerpos monoclonales: Biotina de ratón anti-CD8 humano, clon SK1 Biotina de ratón anti-CD11b humano, clon ICRF44 Biotina de ratón anti-CD16 humano, clon 3G8 Biotina de ratón anti-CD19 humano, clon HIB19 Biotina de ratón anti-CD36 humano, clon CB38 Biotina de ratón anti-CD41a humano, clon HIP8 Biotina de ratón anti-CD45RO humano, clon UCHL1 Biotina de ratón anti-CD56 humano, clon B159 Biotina de ratón anti-CD123 humano, clon 9F5 Biotina de ratón anti-γδ-TCR humano, clon B1 Biotina de ratón anti-Glicoforina A humana, clon GA-R2
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas vírgenes tiñe simultáneamente eritrocitos, plaquetas y la mayoría de los leucocitos, excepto las células T auxiliares CD4+ vírgenes. Después de eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular y se unen a las células que llevan los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca entonces dentro del campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). A continuación, se realiza una selección negativa para enriquecer las células T CD4+ vírgenes no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se diagraman en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones positivas y enriquecidas se pueden evaluar en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos biotinilados en el cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas naïve se han optimizado y prediluido para proporcionar la máxima eficiencia para el enriquecimiento de células T CD4+ naïve de PBMC. PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO Y MARCAJE MAGNÉTICO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC de sangre humana anticoagulada, preferiblemente por centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque™.* 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 50×10E6 células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas naïve a 5 μl por 1×10E6 células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen 10X de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 × g durante 10 minutos y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. 6. Mezcle bien con vórtex las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM y resuspenda el pellet celular en 7,5 μl de partículas por 1×10E6 células. Tenga en cuenta que este volumen de partículas de estreptavidina IMag es mayor que el utilizado en la mayoría de los sets de enriquecimiento BD IMag y que este set contiene un mayor volumen total de estas partículas para compensar esta diferencia. 7. MEZCLAR COMPLETAMENTE. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Ajustar el volumen de marcaje a una concentración de 10 a 80×10E6 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transferir las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12×75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular BD IMag™ (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. Para un mayor volumen, divida las células en varios tubos de ensayo de fondo redondo de 12 × 75 mm o transfiéralas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 × 100 mm. El volumen máximo añadido no debe exceder los 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular BD IMag™ (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular BD IMag™ y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular BD IMag™ y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de la fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces (evite crear burbujas) y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular BD IMag™ durante 6 a 8 minutos. • Para el tubo de 17 × 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular BD IMag™ durante 8 minutos. 12. Con una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene células CD4+ vírgenes sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. 14. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada, coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular BD IMag™ durante otros 3-10 minutos. Un mayor tiempo de imán aumentará la pureza, pero reducirá la recuperación. • Para el tubo de 17 × 100 mm: Coloque en el imán de separación celular BD IMag™ durante 6 minutos. 15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción CD4 + naïve enriquecida dos veces. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular total, las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Consejos para una preparación celular exitosa: • Extraiga la sangre en un tubo que contenga EDTA • Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. • Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. • Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y continúe con el paso 3. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D