BD, 559064, BD Pharmingen™ Anti-TNF de ratón purificado para ratas

Nombre alternativo: Tnf; Tnfa; TNF alfa; TNF-a; Tnfsf1a; Tnfsf2; TNFSF2; caquectina; DIF
Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Isotipo: IgG1 de rata
Inmunógeno: TNF de ratón recombinante
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (probada rutinariamente), inmunocitoquímica (probada durante el desarrollo)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2271896
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Inmunocitoquímica: El formato ICC del anticuerpo MP6-XT22 purificado (n.° de cat. 559064) puede utilizarse para identificar y enumerar células productoras de TNF mediante inmunocitoquímica. Para una tinción inmunocitoquímica indirecta óptima, el anticuerpo MP6XT22 debe titularse (≤ 1 µg) y visualizarse mediante un procedimiento de tinción de tres pasos con IgG de cabra anti-rata con biotina y estreptavidina con peroxidasa de rábano picante (HRP). A continuación, se detalla el protocolo del procedimiento. Para una detección óptima de células productoras de citocinas, se recomienda la peroxidasa de rábano picante. REACTIVOS REQUERIDOS PARA EL PROTOCOLO DE INMUNOCITOQUÍMICA DE CITOQUINAS 1. Tampón de fijación: Tampón de fijación ICC BD Pharmingen™ (BD, n.º de cat. 550010) o formalina al 5 % (formalina al 10 %, CMS, n.º de cat. 245-684) disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón Bacto FA, Difco Laboratories, n.º de cat. 2314-15-0). 2. Tampón bloqueador de peroxidasa endógena: Reactivo bloqueador de peroxidasa DAKO (DAKO, n.º de cat. S2001). 3. Tampón bloqueador de biotina endógena: Kit bloqueador de biotina/avidina (Vector Laboratories, n.º de cat. SP-2001). 4. Tampón de dilución de anticuerpos: Diluyente de anticuerpos para IHC BD Pharmin gen™, cat. N.º 559148, suplementado con saponina 5. Portaobjetos microscópicos: portaobjetos de adhesión (Erie Scientific Company, n.º de cat. ER-202B-AD) o para citocentrifugaciones, portaobjetos Colorfrost/Plus (Fisher, n.º de cat. 12-550-17). 6. Biotina de cabra anti-IgG de rata (n.º de cat. 559286) o kit de detección de anti-Ig de rata HRP (n.º de cat. 551013). 7. Sistema de detección: BD Pharmingen™ Streptavidin-HRP (n.º de cat. 550946) o kit de detección de anti-Ig de rata HRP (n.º de cat. 551013). 8. Medio de montaje para almacenamiento a corto plazo: Aqua-mount® (Lerner Laboratories, n.º de cat. 13800). 9. Kit de sustrato DAB (contiene tetraclorhidrato de 3-3-diaminobencidina), (BD Cat. No. 550880), o kit de detección de Ig HRP anti-rata (Cat. No. 551013). PROCEDIMIENTO PARA LA TINCIÓN INMUNOCITOQUÍMICA DE PREPARACIONES DE CÉLULAS INDIVIDUALES Este procedimiento describe la técnica inmunoenzimática de tinción de citocinas dentro de células individuales que se inmovilizan en portaobjetos microscópicos mediante adherencia (portaobjetos adherentes) o centrifugación (citocentrifugación). PORTAOBJETOS DE ADHERENCIA 1. Coseche las células y lávelas dos veces en PBS usando centrifugación (400 xg durante 5 min) para eliminar la proteína residual. 2. Ajuste la concentración celular a 4-5 x 10e6 células/ml en PBS. 3. Coloque 20 µl de la suspensión celular en cada pocillo de los portaobjetos de adhesión y déjelos adherirse a temperatura ambiente (TA) durante 20 min. Tenga en cuenta que los portaobjetos deben lavarse en PBS a TA durante 5 min antes de transferir las células. 4. Fije las células en los portaobjetos utilizando tampón de fijación (n.º de cat. 550010) durante 15 min a TA. 5. Lave los portaobjetos 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 6. Bloquee los portaobjetos con PBS suplementado con BSA al 1 % (p/v) (Sigma, n.º de cat. A43-78) durante 30 min a TA o 10 min a 37 °C. 7. Lave los portaobjetos 2 veces en PBS y proceda con la tinción o séquelos al aire y almacénelos a -80 °C para uso futuro. 8. Incube los portaobjetos con 20 µl de suero de cabra al 1 % y PBS con saponina al 0,1 % (p/v) durante 30 min a TA. 9. Lave los portaobjetos 2 veces con PBS con incubaciones de 5 min. 10. Bloquee la actividad de la peroxidasa endógena con el tampón bloqueador de peroxidasa endógena (20 µl/pocillo) durante 10 min a temperatura ambiente. 11. Lave 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 12. Incube cada pocillo con avidina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 13. Lave 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 14. Incube cada pocillo con biotina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 15. Lave 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 16. Incube cada pocillo durante 1 h a temperatura ambiente con 20 µl de anticuerpo específico de citocina purificado o un control de isotipo de inmunoglobulina adecuado diluido en tampón diluyente de IHC de Pharmingen (n.º de cat. 559148), suplementado con saponina. 17. Lavar los portaobjetos 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 18. Incubar cada pocillo con 20 µl de un anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón diluyente de IHC durante 30 min a TA. 19. Lavar 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 20. Aplicar 20 µl de estreptavidina-HRP (BD Cat. No. 550946) a cada pocillo de los portaobjetos e incubar durante 30 min a TA. 21. Lavar los portaobjetos 2X con PBS con incubaciones de 5 minutos. 22. Incubar con sustrato DAB como se indica, (BD Cat. No. 550880) durante menos de 5 min a TA. 23. Detener el desarrollo de la reacción de color lavando con PBS. 24. Los portaobjetos se montan posteriormente en medio de montaje de almacenamiento a corto plazo. CYTOSPINS 1. Monte la cámara de muestra de Cytospin (p. ej., Cytospin 3, Shandon, Reino Unido, o una centrífuga comparable), la tarjeta de filtro, el portaobjetos y los soportes de citocentrifugación según las especificaciones del fabricante. 2. Cargue 40 µl de aproximadamente 1 x 10e6 células en cada cámara de muestra. 3. Centrifugue los portaobjetos a 600 rpm durante 2 min. 4. Retire los portaobjetos del soporte de citocentrifugación y colóquelos en un soporte de tinción. 5. Para la fijación y la tinción, siga los pasos 4 a 24 especificados anteriormente para la tinción de células en portaobjetos de adhesión.
Avisos del producto: Avisos del producto Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben usarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.