BD, 559068, BD Pharmingen™ Anti-IL-6 humana purificada de rata

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: IgG2a de rata, κ
Inmunógeno: IL-6 humana recombinante
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente), citometría de flujo/bloqueo intracelular (probada durante el desarrollo)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_398660
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Inmunocitoquímica: La anti-IL-6 humana de rata purificada (n.º de cat. 559068) se puede utilizar para identificar y enumerar células productoras de IL-6 humana mediante inmunocitoquímica. Para una tinción inmunocitoquímica indirecta óptima, el anticuerpo MQ2-6A3 debe titularse (≤ 1 µg) y visualizarse mediante un procedimiento de tinción de tres pasos en combinación con IgG de cabra anti-rata con biotina (n.º de cat. 559286) y estreptavidina-HRP (n.º de cat. 550946). * El método de avidina/biotina es un método altamente sensible para la detección de citocinas asociadas a células individuales. Emplea una mezcla de avidina y complejos enzimáticos biotinilados para aumentar las señales inmunoenzimáticas. Para una detección óptima de células productoras de citocinas, Pharmingen recomienda la peroxidasa de rábano picante como el sistema enzimático preferido. REACTIVOS REQUERIDOS PARA EL PROTOCOLO DE INMUNOCITOQUÍMICA DE CITOQUINAS 1. Tampón de fijación: se disuelve formalina al 5% (formalina al 10%, CMS, n.º de cat. 245-684) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón Bacto® FA, Difco Laboratories, n.º de cat. 2314-15-0) o tampón de fijación ICC BD Pharmingen™ (BD n.º de cat. 550010). 2. Tampón bloqueador de peroxidasa endógena: reactivo bloqueador de peroxidasa DAKO (DAKO, n.º de cat. S2001). 3. Tampón bloqueador de biotina endógena: kit bloqueador de biotina/avidina (Vector Laboratories, n.º de cat. SP-2001). 4. Tampón de dilución de anticuerpos: Diluyente de anticuerpos de Pharmingen para IHC (n.° de cat. 559148) suplementado con saponina. 5. Portaobjetos microscópicos: Portaobjetos de adhesión (Erie Scientific Company, n.° de cat. ER-202B-AD) o, para citocentrifugación, portaobjetos Colorfrost®/Plus (Fisher, n.° de cat. 12-550-17). 6. Estreptavidina - HRP (n.° de cat. 550946) o el kit de detección de Ig antirratón HRP (n.° de cat. 551011). 7. Medio de montaje para almacenamiento a corto plazo: Aqua-mount® (Lerner Laboratories, n.° de cat. 13800). 8. Kit de sustrato DAB (n.º de cat. 550880) o kit de detección de anti-rata Ig HRP (n.º de cat. 551013). ANTICUERPO SECUNDARIO 1. IgG de cabra anti-rata con biotina (n.º de cat. 559286) o kit de detección de anti-rata Ig HRP (n.º de cat. 551013), que contiene todos los reactivos de detección necesarios. PROCEDIMIENTO PARA LA TINCIÓN INMUNOCITOQUÍMICA DE PREPARACIONES DE CÉLULAS INDIVIDUALES Este procedimiento describe la técnica inmunoenzimática de tinción de citocinas dentro de células individuales que se inmovilizan en portaobjetos microscópicos mediante adherencia (portaobjetos adherentes) o centrifugación (citocentrifugación). PORTAOBJETOS DE ADHERENCIA 1. Coseche las células y lávelas dos veces en PBS mediante centrifugación (400 xg durante 5 min) para eliminar la proteína residual. 2. Ajuste la concentración celular a 4 x 10×6 a 5 x 10×6 células/ml en PBS. 3. Coloque 20 µl de la suspensión celular en cada pocillo de los portaobjetos de adhesión y déjelos adherir a temperatura ambiente (TA) durante 20 min. Tenga en cuenta que los portaobjetos deben lavarse en PBS a TA durante 5 min antes de transferir las células. 4. Fije las células en los portaobjetos utilizando tampón de fijación durante 15 min a TA. 5. Lave los portaobjetos 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 6. Bloquee los portaobjetos con PBS suplementado con 1% (p/v) de BSA (Sigma, Cat. No. A43-78) durante 30 min a TA o 10 min a 37 °C. 7. Lave los portaobjetos 2X en PBS y proceda con la tinción o séquelos al aire y guárdelos a -80 °C para su uso futuro. 8. Incubar los portaobjetos con 20 µl de suero de cabra al 1% y PBS con saponina al 0,1% (p/v) durante 30 min a temperatura ambiente. 9. Lavar los portaobjetos 2 veces con PBS con incubaciones de 5 min. 10. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena con tampón bloqueador de peroxidasa endógena (20 µl/pocillo) durante 10 min a temperatura ambiente. 11. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 12. Incubar cada pocillo con avidina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 13. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 14. Incubar cada pocillo con biotina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 15. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 16. Incubar cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente con 20 µl de anticuerpo específico de citocina purificado o control de isotipo de inmunoglobulina adecuado diluido en diluyente IHC de Pharmingen (n.º de cat. 559148) suplementado con saponina. 17. Lavar los portaobjetos 2 veces en PBS con incubaciones de 5 minutos. 18. Incubar cada pocillo con 20 µl de un anticuerpo secundario biotinilado diluido en diluyente IHC durante 30 minutos a temperatura ambiente. 19. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 minutos. 20. Aplicar 20 µl de estreptavidina . HRP (n.º de cat. 550946) a cada pocillo de los portaobjetos e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 21. Lavar los portaobjetos 2 veces con PBS con incubaciones de 5 minutos. 22. Incubar con tetraclorhidrato de 3-3'-diaminobencidina (DAB), (n.º de cat. 550880) durante menos de 5 min a temperatura ambiente. 23. Detener el desarrollo de la reacción de color lavando con PBS. 24. Los portaobjetos se montan posteriormente en un medio de montículo de almacenamiento a corto plazo. CITOSPINS 1. Ensamble la cámara de muestra de Cytospin (p. ej., Cytospin 3, Shandon, Reino Unido o una centrífuga comparable), la tarjeta de filtro, el portaobjetos y los bastidores de citocentrifugación según las especificaciones del fabricante. 2. Cargue 40 µl de aproximadamente 1 × 10×6 células en cada cámara de muestra. 3. Centrifugue los portaobjetos a 600 rpm durante 2 min. 4. Retire los portaobjetos del bastidor de citocentrifugación y colóquelos en un bastidor de tinción. 5. Para la fijación y la tinción, siga los pasos del 4 al 24 especificados anteriormente para teñir células en portaobjetos de adhesión.
Avisos del producto: Avisos del producto. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este agente conservante no deben utilizarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa, o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las hojas de datos de seguridad (SDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.