BD, 559072, Control de isotipo κ IgG1 de rata purificado BD Pharmingen™

Nombre alternativo: Control de isotipo kappa IgG1
Isotipo: IgG1 de rata, κ
Inmunógeno: inmunoglobulina de ratón
Aplicación: Estándar ELISA, Citometría de flujo, Control de isotipo (Probado rutinariamente), Inmunohistoquímica-formalina (requiere recuperación de antígeno), Inmunohistoquímica-congelado, Inmunohistoquímica-fijado con zinc (Probado durante el desarrollo)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_397192
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Inmunocitoquímica: Se advierte a los investigadores que este puro no se analiza rutinariamente utilizando la aplicación de inmunocitoquímica (Cytospins). Este material es un control de isotipo de inmunoglobulina para IgG1 de rata y se puede utilizar para determinar el nivel de tinción de fondo no específica en un ensayo inmunocitoquímico indirecto de citocinas. El anticuerpo R3-34 purificado se debe utilizar a la misma concentración que el anticuerpo específico primario y visualizarse en las mismas condiciones mediante un procedimiento de tinción de tres pasos en combinación con Biotin Goat Anti-Rat IgG (Cat. No. 559286) y un sistema de detección de avidina o estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Cat. No. 550946). PROTOCOLO DE INMUNOCITOQUÍMICA DE CITOQUINAS Este procedimiento describe la técnica inmunoenzimática de tinción de citoquinas dentro de células individuales que se inmovilizan en portaobjetos microscópicos mediante adherencia (portaobjetos adherentes) o centrifugación (citocentrifugación). REACTIVOS REQUERIDOS 1. Tampón de fijación: se disuelve formalina al 5% (formalina al 10%, CMS, n.º de cat. 245-684) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón Bacto FA, Difco Laboratories, n.º de cat. 2314-15-0) o tampón de fijación ICC BD Pharmingen™ (BD n.º de cat. 550010) 2. Tampón bloqueador de peroxidasa endógena: reactivo bloqueador de peroxidasa DAKO (DAKO, n.º de cat. S2001). 3. Tampón bloqueador de biotina endógena: Kit bloqueador de biotina/avidina (Vector Laboratories, n.º de cat. SP-2001). 4. Tampón de dilución de anticuerpos: Tampón diluyente de ICC de citocinas BD Pharmingen™ suplementado con saponina (BD n.º de cat. 550009). 5. Portaobjetos: Portaobjetos de adhesión (Erie Scientific Company, n.º de cat. ER-202B-AD) o, para citocentrifugación, portaobjetos Colorfrost/Plus (Fisher, n.º de cat. 12-550-17). 6. Sistema de detección: Kit de detección de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) BD Pharmingen™ (n.º de cat. 550946) o kit de detección de Ig anti-rata HRP (n.º de cat. 551013). 7. Medio de montaje para almacenamiento a corto plazo: Aqua-mount® (Lerner Laboratories, n.º de cat. 13800). 8. Kit de sustrato DAB (contiene tetraclorhidrato de 3-3-diaminobencidina) (BD, n.º de cat. 550880) o kit de detección de Ig anti-rata HRP (n.º de cat. 551013). ANTICUERPOS SECUNDARIOS: 1. IgG de cabra anti-rata con biotina (n.º de cat. 559286) o kit de detección de Ig anti-rata HRP (n.º de cat. 551013). 2. IgG de cabra anti-ratón con biotina (n.º de cat. 550337) o kit de detección de Ig anti-ratón HRP (n.º de cat. 551011). PORTAOBJETOS DE ADHESIÓN 1. Coseche las células y lávelas dos veces en PBS mediante centrifugación (400 xg durante 5 min) para eliminar la proteína residual. 2. Ajuste la concentración celular a 4-5 x 10e6 células/ml en PBS. 3. Coloque 20 µl de la suspensión celular en cada pocillo de los portaobjetos de adhesión y deje que se adhieran a temperatura ambiente (TA) durante 20 min. Tenga en cuenta que los portaobjetos deben lavarse en PBS a TA durante 5 min antes de transferir las células. 4. Fije las células en los portaobjetos utilizando tampón de fijación durante 15 min a TA. 5. Lave los portaobjetos 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 6. Bloquee los portaobjetos con PBS suplementado con 1% (p/v) de BSA (Sigma, Cat. No. A43-78) durante 30 min a TA o 10 min a 37 °C. 7. Lave los portaobjetos 2X en PBS y proceda con la tinción o séquelos al aire y almacénelos a -80 °C para uso futuro. 8. Incube los portaobjetos con 20 µl de suero de cabra al 1% y PBS con saponina al 0,1% (p/v) durante 30 min a TA. 9. Lave los portaobjetos 2X con PBS con incubaciones de 5 min. 10. Bloquee la actividad de peroxidasa endógena con tampón bloqueador de peroxidasa endógena (20 µl/pocillo) durante 10 min a TA. 11. Lave 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 12. Incube cada pocillo con avidina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 13. Lave 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 14. Incube cada pocillo con biotina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 15. Lavar 2X en PBS con 5 min de incubación. 16. Incubar cada pocillo durante 1 h a TA con 20 µl de anticuerpo específico de citocina purificado o control de isotipo de inmunoglobulina adecuado diluido en tampón diluyente ICC de citocinas de Pharmingen suplementado con saponina. 17. Lavar los portaobjetos 2X en PBS con 5 min de incubación. 18. Incubar cada pocillo con 20 µl de un anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón diluyente ICC de citocinas durante 30 min a TA. 19. Lavar 2X en PBS con 5 min de incubación. 20. Aplicar 20 µl de estreptavidina-HRP (BD Cat. No. 550946) a cada pocillo de los portaobjetos e incubar durante 30 min a TA. 21. Lavar los portaobjetos 2X con PBS con 5 minutos de incubación. 22. Incubar con sustrato DAB según las instrucciones (BD Cat. No. 550880) durante menos de 5 min a TA. 23. Detener el desarrollo de la reacción de color lavando con PBS. 24. Los portaobjetos se montan posteriormente en un medio de montaje para almacenamiento a corto plazo. CITOSPINS 1. Montar la cámara de muestra de Cytospin (p. ej., Cytospin 3, Shandon, Reino Unido o una centrífuga comparable), la tarjeta de filtro, los portaobjetos y los bastidores de citocentrifugación según las especificaciones del fabricante. 2. Cargar 40 µl de aproximadamente 1 x 10e6 células en cada cámara de muestra. 3. Centrifugar los portaobjetos a 600 rpm durante 2 min. 4. Sacar los portaobjetos del bastidor de citocentrifugación y colocarlos en un bastidor de tinción. 5. Para la fijación y la tinción, seguir los pasos del 4 al 24 especificados anteriormente para teñir células en portaobjetos de adhesión.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés.