BD, 559076, BD Pharmingen™ Anti-IL-10 humana purificada de rata

Reactividad: Humana (Prueba de control de calidad), Viral (Probado en desarrollo)
Isotipo: IgG2a de rata
Inmunógeno: IL-10 humana
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2233691
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Inmunocitoquímica: El anticuerpo anti-IL-10 humana purificado de rata (n.° de cat. 559076) puede utilizarse para identificar y enumerar células productoras de IL-10 humana mediante inmunocitoquímica. Para una tinción inmunocitoquímica indirecta óptima, el anticuerpo JES3-12G8 debe titularse y visualizarse mediante un procedimiento de tinción de tres pasos en combinación con IgG de cabra anti-rata con biotina y un sistema de detección de peroxidasa de rábano picante con avidina/estreptavidina. A continuación, se detalla el protocolo para el procedimiento inmunocitoquímico de citocinas. REACTIVOS REQUERIDOS PARA EL PROTOCOLO DE INMUNOCITOQUÍMICA DE CITOQUINAS 1. Tampón de fijación: se disuelve formalina al 5% (formalina al 10%, CMS, n.º de cat. 245-684) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón Bacto FA, Difco Laboratories, n.º de cat. 2314-15-0) o tampón de fijación ICC BD Pharmingen™ (BD n.º de cat. 550010). 2. Tampón bloqueador de peroxidasa endógena: reactivo bloqueador de peroxidasa DAKO (DAKO, n.º de cat. S2001). 3. Tampón bloqueador de biotina endógena: kit bloqueador de biotina/avidina (Vector Laboratories, n.º de cat. SP-2001). 4. Tampón de dilución de anticuerpos: diluyente de anticuerpos BD Pharmingen™ para IHC, n.º de cat. N.º 559148, suplementado con saponina. 5. Portaobjetos microscópicos: Portaobjetos de adhesión (Erie Scientific Company, n.º de cat. ER-202B-AD) o, para citocentrifugación, portaobjetos Colorfrost/Plus (Fisher, n.º de cat. 12-550-17). 6. Sistema de detección: BD Pharmingen™ Estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP), (n.º de cat. 550946) o kit de detección de Ig anti-rata HRP (n.º de cat. 551013). 7. Medio de montaje para almacenamiento a corto plazo: Aqua-mount® (Lerner Laboratories, n.º de cat. 13800). 8. Kit de sustrato DAB (contiene tetraclorhidrato de 3-3-diaminobencidina), (BD Cat. No. 550880), o kit de detección de Ig HRP anti-rata (Cat. No. 551013). ANTICUERPOS SECUNDARIOS 1. IgG anti-rata de cabra con biotina (Cat. No. 559286) o kit de detección de Ig HRP anti-rata (Cat. No. 551013). PROCEDIMIENTO PARA LA TINCIÓN INMUNOCITOQUÍMICA DE PREPARACIONES DE CÉLULAS INDIVIDUALES Este procedimiento describe la técnica inmunoenzimática de tinción de citocinas dentro de células individuales que se inmovilizan en portaobjetos microscópicos mediante adherencia (portaobjetos adherentes) o centrifugación (citocentrifugación). PORTAOBJETOS DE ADHERENCIA 1. Coseche las células y lávelas dos veces en PBS mediante centrifugación (400 xg durante 5 min) para eliminar la proteína residual. 2. Ajuste la concentración celular a 4-5 x 10×6 células/ml en PBS. 3. Coloque 20 µl de la suspensión celular en cada pocillo de los portaobjetos de adhesión y déjelos adherir a temperatura ambiente (TA) durante 20 min. Tenga en cuenta que los portaobjetos deben lavarse en PBS a TA durante 5 min antes de transferir las células. 4. Fije las células en los portaobjetos utilizando tampón de fijación durante 15 min a TA. 5. Lave los portaobjetos 2X en PBS con incubaciones de 5 min. 6. Bloquee los portaobjetos con PBS suplementado con 1% (p/v) de BSA (Sigma, Cat. No. A43-78) durante 30 min a TA o 10 min a 37 °C. 7. Lave los portaobjetos 2X en PBS y proceda con la tinción o séquelos al aire y guárdelos a -80 °C para su uso futuro. 8. Incubar los portaobjetos con 20 µl de suero de cabra al 1% y PBS con saponina al 0,1% (p/v) durante 30 min a temperatura ambiente. 9. Lavar los portaobjetos 2 veces con PBS con incubaciones de 5 min. 10. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena con tampón bloqueador de peroxidasa endógena (20 µl/pocillo) durante 10 min a temperatura ambiente. 11. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 12. Incubar cada pocillo con avidina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 13. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 14. Incubar cada pocillo con biotina (20 µl/pocillo) durante 15 min. 15. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 min. 16. Incubar cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente con 20 µl de anticuerpo específico de citocina purificado o control de isotipo de inmunoglobulina adecuado diluido en diluyente de anticuerpos para IHC, n.º de cat. 559148, suplementado con saponina. 17. Lavar los portaobjetos 2 veces en PBS con incubaciones de 5 minutos. 18. Incubar cada pocillo con 20 µl de un anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón diluyente de IHC durante 30 minutos a temperatura ambiente. 19. Lavar 2 veces en PBS con incubaciones de 5 minutos. 20. Aplicar 20 µl de estreptavidina-HRP (BD n.º de cat. 550946) a cada pocillo de los portaobjetos e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 21. Lavar los portaobjetos 2 veces con PBS con incubaciones de 5 minutos. 22. Incubar con sustrato DAB según las instrucciones (BD Cat. No. 550880) durante menos de 5 min a TA. 23. Detener el desarrollo de la reacción de color lavando con PBS. 24. Los portaobjetos se montan posteriormente en un medio de montaje para almacenamiento a corto plazo. CITOSPINS 1. Montar la cámara de muestra de Cytospin (p. ej., Cytospin 3, Shandon, Reino Unido o una centrífuga comparable), la tarjeta de filtro, el portaobjetos y los bastidores de citocentrifugación según las especificaciones del fabricante. 2. Cargar 40 µl de aproximadamente 1 x 10×6 células en cada cámara de muestra. 3. Centrifugar los portaobjetos a 600 rpm durante 2 min. 4. Sacar los portaobjetos del bastidor de citocentrifugación y colocarlos en un bastidor de tinción. 5. Para la fijación y la tinción, seguir los pasos del 4 al 24 especificados anteriormente para teñir células en portaobjetos de adhesión.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La azida sódica es un inhibidor reversible del metabolismo oxidativo; por lo tanto, las preparaciones de anticuerpos que contienen este conservante no deben utilizarse en cultivos celulares ni inyectarse en animales. La azida sódica puede eliminarse lavando las células teñidas o el anticuerpo unido a la placa, o dializando el anticuerpo soluble en un tampón sin azida sódica. Dado que la endotoxina también puede afectar los resultados de los estudios funcionales, recomendamos el formato de anticuerpo NA/LE (sin azida/bajo endotoxina), si está disponible, para uso in vitro e in vivo. Es posible que la reactividad cruzada detectada durante el desarrollo del producto no se haya confirmado en todos los formatos o aplicaciones. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.