BD, 559268, Conjunto ELISA de IL-15 humana BD OptEIA™

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869260
Descripción: El set BD OptEIA™ para IL-15 humana contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para IL-15 humana natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo, tal como se especifica en este paquete. Optimización del ensayo: Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño flexible del ensayo para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden modificar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección; temperatura de incubación; formulación del diluyente de ensayo; pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas; tipo de sustrato; técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: El estándar de este set está calibrado frente a IL-15 humana recombinante expresada en baculovirus purificada, producida en BD Biosciences Pharmingen.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato 0,1 M, pH 9,5; 8,40 g de NaHCO3, 3,56 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato TMB de BD Pharmingen™ (n.º de cat. 555214). 5. Solución de parada: H3PO4 1 M o H2SO4 2 N Materiales adicionales necesarios 1. Placas de micropocillos; se recomiendan las placas ELISA BD Falcon™ (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta de un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado por centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y deje que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: Recoja el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar a temperatura ambiente, abra cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de hacer diluciones. Mezcle suavemente con vórtex. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, inmediatamente** alícuota la solución madre del estándar a 50 μl por vial y congélela a ≤ -70 °C durante un máximo de 6 meses. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarla/congelarla. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 500 pg/mL a partir de la solución madre del estándar. Mezcle con vórtex. b. Agregue 300 μL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquete como 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL, 15,6 pg/mL y 7,8 pg/mL. c. Realice diluciones seriadas añadiendo 300 μL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Nota sobre la preparación del detector de trabajo: incubación en un solo paso de los reactivos de biotina/estreptavidina. Agregue el volumen requerido de anticuerpo de detección al diluyente de ensayo. Dentro de los 15 minutos anteriores al uso, agregue la cantidad requerida de reactivo enzimático, agite con vórtex o mezcle bien. Para una placa de 96 pocillos completa, prepare 12 mL de detector de trabajo. Advertencias y precauciones 1. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. 2. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. 3. El anticuerpo de captura contiene <0,1% de azida sódica. La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. 4. El anticuerpo de detección contiene 1 % de BSA y ProClin™-150 como conservante. 5. El reactivo enzimático contiene 1 % de BSA y ProClin™-300 como conservante. 6. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Procedimiento de ensayo recomendado 1. Cubra los micropocillos con 100 μL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire los pocillos y lave 3 veces con ≥ 300 μL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 μL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 μL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Selle la placa e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 5 lavados en total. 8. Añada 100 μL del detector de trabajo preparado (anticuerpo de detección + reactivo SAv-HRP) a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este último paso de lavado, sumerja los pocillos en el tampón de lavado de 30 segundos a 1 minuto por cada lavado. 10. Añada 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 11. Añada 50 μL de solución de parada a cada pocillo. 12. Lea la absorbancia a 450 nm en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Si dispone de corrección de longitud de onda, reste la absorbancia de 570 nm de la absorbancia de 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añada 100 μL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incube durante la noche a 4 °C 2. Aspire y lave 3 veces. 3. Bloquee las placas: 200 μL de diluyente de ensayo en cada pocillo. Incube 1 h. TA 4. Aspire y lave 3 veces 5. Añada 100 μL de estándar o muestra a cada pocillo. Incuba 2 h. RT 6. Aspirar y lavar 5 veces 7. Agregar 100 μL de detector de trabajo (Ab de detección + SAv-HRP) a cada pocillo. Incubar 1 h. RT 8. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min) 9. Agregar 100 μL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 min. RT en oscuridad 10. Agregar 50 μL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm en 30 min. Corrección λ 570 nm. Cálculo de resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia estándar media cero de cada uno. Graficar la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de IL-15 en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de IL-15 de las muestras desconocidas, calcule su valor medio de absorbancia en el eje Y y trace una línea horizontal hasta la curva estándar. En el punto de intersección, trace una línea vertical hasta el eje X y lea la concentración de IL-15. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de IL-15 por el factor de dilución. También se puede utilizar la reducción de datos computacional mediante análisis de regresión lineal. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se analizaron en el ensayo OptEIA™ a 10 ng/mL y no se identificó reactividad cruzada.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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