BD, 559971, Panel de linaje de ratones con biotina BD Pharmingen™

Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_10053179
Descripción: El panel de linaje murino ha sido diseñado para reaccionar con células de los principales linajes hematopoyéticos, como linfocitos T, linfocitos B, monocitos/macrófagos, granulocitos y eritrocitos. Este panel, compuesto por cinco anticuerpos biotinilados prediluidos, está diseñado para el enriquecimiento por citometría de flujo o inmunomagnético de progenitores hematopoyéticos de médula ósea de ratón mediante la depleción de células asociadas a los linajes linfocítico T y B, mieloide (monocítico y granulocítico) y eritroide. El panel contiene suficientes reactivos para teñir 10^9 células de médula ósea.
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A continuación se presenta un protocolo de etiquetado detallado. En resumen, los anticuerpos conjugados con biotina tiñen simultáneamente las células comprometidas con el linaje según sus diferentes especificidades. Dos microlitros de cada conjugado de anticuerpo prediluido son suficientes para teñir 10^6 células en 10 µl de tampón de tinción. Luego se realiza una selección negativa para enriquecer los progenitores hematopoyéticos no comprometidos. El panel de linaje de ratón se puede utilizar con una eficiencia similar con sistemas de separación de partículas magnéticas o clasificación celular por citometría de flujo. Para mayor comodidad, todos los anticuerpos se han optimizado y prediluido para proporcionar la máxima eficiencia en la separación celular. Los anticuerpos se proporcionan en viales separados para garantizar la estabilidad del producto y permitir la flexibilidad de los protocolos de separación. Las células progenitoras hematopoyéticas separadas después de la tinción con el panel de linaje de ratón se han probado en análisis de citometría de flujo, ensayos de colonias en metilcelulosa, microscopía de tinción diferencial, inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western. El uso del panel de linaje de ratón no altera la morfología, el fenotipo ni la función de las células separadas en dichos ensayos. PROTOCOLO DE ETIQUETADO PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE CÉLULAS PROGENITORAS HEMATOPOYÉTICAS 1. Prepare una suspensión de células individuales de médula ósea u otro órgano hematopoyético. Notas: -Los fémures y las tibias de un ratón adulto suelen producir de 20 a 60 × 10^6 células hematopoyéticas. Dos ratones producirán de 0,5 a 1,0 × 10^6 células negativas al linaje. -La presencia de glóbulos rojos (RBC) no afecta la tinción con el panel de linaje de ratón. Hemos observado que la lisis inicial de los RBC, utilizando cloruro de amonio tamponado, reduce la eficacia de la tinción. La separación celular por gradiente puede ser más apropiada. Si se requiere la lisis de los RBC para un análisis posterior, debe realizarse después del procedimiento de separación. -Si las células separadas se van a utilizar para cultivo o ensayos in vivo, se deben utilizar condiciones asépticas y medios/tampones estériles. 2. Cuente las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular [p. ej., BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS), n.º de cat. 554656] a una densidad final de 100 × 10^6 células por ml. 3. Reserve una muestra de células sin teñir (~5 × 10^6 células) para utilizar en el análisis de citometría de flujo en el paso 7. 4. Añada los anticuerpos biotinilados del panel de linaje de ratón, utilizando 2 µl de cada anticuerpo prediluido por 10^6 células, e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Lave las células teñidas dos veces, utilizando el tampón recomendado para el sistema de separación celular que se va a utilizar. 6. Resuspenda las células a una densidad final de 20-100 × 10^6 células por ml. Las células teñidas pueden utilizarse en diversos sistemas de separación celular. Notas: -Para cada método de separación, se debe seguir el protocolo recomendado por el fabricante. -Para la clasificación celular mediante citometría de flujo, las células deben marcarse con estreptavidina (o avidina) unida a un fluorocromo adecuado. -Para la separación celular inmunomagnética mediante una columna de separación magnética de alto gradiente, las células deben marcarse con las partículas magnéticas unidas a estreptavidina adecuadas (p. ej., BD™ IMag Streptavidin Particles Plus - MSC, n.º de cat. 557811). Para la separación celular inmunomagnética mediante el imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311), recomendamos el juego de enriquecimiento de células progenitoras hematopoyéticas de ratón BD™ IMag - DM, n.º de cat. N.° 558451). 7. Las muestras de la suspensión celular total, así como las fracciones de linaje positivo y negativo, deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficacia del procedimiento de separación celular. Nota: La concentración recomendada de anticuerpos del Panel de Linaje de Ratón no es saturante y permite la tinción de las fracciones de linaje positivo y negativo separadas con los mismos anticuerpos monoclonales utilizados para la depleción.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 2.0 : N/D : N/D