BD, 560064, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 555 Anti-E-cadherina de ratón

Nombre alternativo: CD324; CDH1; CADH1; cadherina-1; ECAD; CDHE; Arco-1; LCAM; UVO; Uvomorulina
Reactividad: Humano (prueba de control de calidad), Ratón (probado en desarrollo), Rata, Perro (reactividad confirmada en desarrollo)
Isotipo: IgG2a de ratón, κ
Inmunógeno: proteína recombinante C-terminal de la E-cadherina humana
Aplicación: Bioimagen (Probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645384
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 555 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 555 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Para secciones de tejido 1. Coseche los órganos o tejidos diana y lávelos con PBS. 2. Coloque los tejidos en casetes y fíjelos con formalina tamponada neutra al 10 % (Fisher SF100-4) durante 16 horas. 3. Retire el fijador y proceda con el procesamiento e inclusión en parafina utilizando protocolos estándar.* 4. Corte secciones de tejido incluidas en parafina (5 µm) utilizando un micrótomo, adhiera las secciones a portaobjetos colorfrost (Fisher 12-550-17) y déjelas secar al aire.* 5. Desparafine y rehidrate las secciones.* 6. Trate con solución BD Retrievagen A (Cat. No. 550524) calentando los portaobjetos en una olla a presión a 121 °C durante 15 minutos a 17 psi.* 7. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente en el Retrievagen A, enjuáguelos con agua del grifo y guárdelos en PBS antes de la tinción de anticuerpos. 8. Las secciones se pueden teñir simultáneamente con una mezcla de múltiples anticuerpos a una concentración preoptimizada, durante 2 horas a temperatura ambiente. 9. Lave las secciones en 1 × PBS, etiquete el ADN celular con 2 µg/ml Hoechst 33342 (Cat. No. 561908) durante 30 minutos, y lave con 1 × PBS. 10. Coloque cubreobjetos en las secciones usando Aqua-Mount (Lerner Labs 13800). 11. Vea y analice las muestras en un instrumento de imágenes apropiado, como el sistema de bioimagen de alto contenido BD Pathway™ 435. * para más detalles por favor visite http://www.bdbiosciences.com/research/cellularimaging/resources/index.jsp Para células cultivadas 1. Siembre las células en un medio de cultivo apropiado a una densidad celular apropiada en una placa de imágenes de 96 pocillos y cultive durante la noche a 48 horas. 2. Retire el medio de cultivo de los pocillos, y lave (una o dos veces) con 100 μl de 1 × PBS. 3. Fije las células añadiendo 100 µl de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS o tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655) a cada pocillo e incubándolos durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). 4. Retire el fijador de los pocillos y lávelos (una o dos veces) con 100 µl de PBS 1×. 5. Permeabilice las células utilizando metanol frío (a), Triton™ X-100 (b) o saponina (c): a. Añada 100 µl de metanol al 90 % a -20 °C o tampón de permeación BD Phosflow™ III a -20 °C (n.º de cat. 558050) a cada pocillo e incube durante 5 minutos a TA. b. Añadir 100 µl de Triton X-100 al 0,1 % a cada pocillo e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. c. Añadir 100 µl de tampón de permeabilización/lavado 1× (n.º de cat. 554723) a cada pocillo e incubar de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Seguir utilizando tampón de permeabilización/lavado 1× para todos los lavados y diluciones posteriores. 6. Retirar el tampón de permeabilización de los pocillos y lavar una o dos veces con 100 µl del tampón adecuado (PBS 1× o tampón de permeabilización/lavado 1×, véase el paso 5.c). 7. Paso de bloqueo opcional: Retire los tampones de lavado y bloquee las células añadiendo 100 µl de tampón de bloqueo BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (n.º de cat. 554656) o FBS al 3 % en el tampón de dilución adecuado a cada pocillo e incubando de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Diluya el anticuerpo hasta su concentración de trabajo óptima en el tampón de dilución adecuado. Titule los anticuerpos purificados (no conjugados) y los reactivos del segundo paso para determinar la concentración óptima. Si utiliza un conjugado de anticuerpo certificado por Bioimaging, dilúyalo 1:10. 9. Añada 50 µl de anticuerpo diluido por pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Incube en la oscuridad si utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia. 10. Retire el anticuerpo y lave los pocillos tres veces con 100 µl de tampón de lavado. Se puede incluir un lavado con detergente opcional (100 μl de Tween al 0,05 % en PBS 1×) antes de los pasos de lavado habituales. 11. Si el anticuerpo que se utiliza está marcado con fluorescencia, pase al paso 12. De lo contrario, si utiliza un anticuerpo purificado sin marcar, repita los pasos 8 a 10 con un reactivo de segundo paso marcado con fluorescencia para detectar el anticuerpo purificado. 12. Después del lavado final, contratine los núcleos añadiendo 100 μl de una solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (n.º de cat. 561908) en PBS 1× a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la adquisición de imágenes. 13. Observe y analice las células en un instrumento de adquisición de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los instrumentos BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 548/20 570LP Fura/FITC BD Pathway 435 543/22 593/40 FF562
Avisos del producto: Avisos del producto Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Este reactivo ha sido prediluido para su uso en el volumen recomendado por prueba cuando se sigue el procedimiento de ensayo recomendado. Una prueba suele ser de ~10 000 células cultivadas en un pocillo de una placa de imágenes de 96 pocillos. Los conjugados de anticuerpos de los colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® de este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analitos. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), el colorante Pacific Blue™ y el colorante Cascade Blue® están cubiertos por patentes pendientes y emitidas. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Triton es una marca registrada de Dow Chemical Company. Es posible que la reactividad cruzada detectada durante el desarrollo del producto no se haya confirmado en todos los formatos o aplicaciones.