BD, 560088, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 647 Ratón anti-IFN-α[2b] humano

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: IFN-α2b humano
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Vol. por prueba: 20 µl
ID de registro: AB_1645416
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Consulte la tabla en la sección Productos complementarios sugeridos para conocer los nombres y las fuentes de los materiales utilizados en el siguiente protocolo Nota sobre la activación celular: Los siguientes procedimientos deben realizarse en la campana utilizando una técnica aséptica. 1. Aísle células mononucleares de sangre periférica humana frescas PBMC de 60 ml de sangre fresca y lave 2X con PBS estéril 1 X. Centrifugue las células a 250 X g durante 10 minutos y deseche el sobrenadante. 2. Suspenda las células en medio completo (RPMI [Hyclone, Cat. No. SH30096] suplementado con 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina y 10% FBS). Cuente y ajuste la concentración celular a 2-3 millones de células/mL. 3. Etiquete dos tubos cónicos estériles de 50 mL como "No estimulado" y "Estimulado con CPG". Dispensar 2 millones de PBMC en cada tubo (2 millones de células/prueba). 4. Añadir 5 µg de oligodesoxinucleótido CPG por ml de células al tubo "Estimulado con CPG". Tapar el tubo y agitar suavemente en vórtex. 5. Incube ambos tubos durante 2 horas a 37 °C. 6. Diluir BD FastImmune™ Brefeldina A (BFA) (n.º de cat. 347688) en una proporción de 1 a 10 en PBS 1X estéril. 7. Añadir 20 µl de BFA 1X por ml a ambos tubos (estimulados y no estimulados). Incube los tubos a 37 °C durante 2 horas. Nota: Mantener las alícuotas de CPG y BFA a -20 °C. 8. Añadir 100 µl de EDTA 20 mM por ml de células a ambos tubos e incubar durante la noche a 4 °C. Tinción superficial e intracelular. 9. Centrifugue los dos tubos a 250 x g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante por aspiración y resuspenda las células en 25 ml de tampón de tinción BD Pharmigen™ (n.º de cat. 554656/554657). 10. Centrifugue los tubos a 250 x g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 2 ml de tampón de tinción. 11. Etiquete adecuadamente los 12 tubos de polipropileno de 75 mm. Añada 100 µl de células a cada tubo. 12. Añada anticuerpos de tinción de superficie a cada tubo (cóctel FITC anti-Lin-1 humano [n.º de cat. 340546], PerCP-Cy™5.5 anti-CD123 humano de ratón [n.º de cat. 558714/560904] y PE anti-HLA-DR humano de ratón [n.º de cat. 555561] o conjugado PE). Incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos en oscuridad. 13. Tras la incubación, añada 2 ml de tampón de tinción frío a cada tubo y centrifugue a 250 X g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets para resuspender las células. 14. Añada 1 ml de tampón BD Cytofix/Cytoperm™ a temperatura ambiente (n.º de cat. 554722) a cada tubo. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. 15. Agregue 2 mL de tampón BD Perm/Wash™ frío (n.º de cat. 554723) a cada tubo y centrifugue a 500 X g durante 5 minutos; deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets para volver a suspender las células. 16. Agregue el anticuerpo de tinción intracelular anti-IFN-alfa humano (20 µl/prueba) o el control de isotipo adecuado en el volumen apropiado por prueba a los tubos y mezcle bien por agitación. Lleve el volumen de prueba a 100 µl usando tampón BD Perm/Wash frío. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 60 minutos en la oscuridad. 17. Agregue 2 mL de tampón BD Perm/Wash frío a cada tubo y centrifugue a 500 X g durante 5 minutos; deseche el sobrenadante por aspiración y agite el pellet para suspender las células. 18. Añada 300 µl de tampón de lavado/permanencia BD frío a cada tubo para un análisis citométrico de flujo inmediato. Opcional: resuspenda los pellets con 200 µl de formaldehído frío al 1 % y mantenga los tubos a 4 °C en la oscuridad hasta 24 horas antes de la citometría de flujo. Si se almacenan durante más de 24 horas, recomendamos lavar las células en tampón de lavado, ya que la incubación prolongada con fijadores podría afectar a los fluorocromos. Citometría de flujo y análisis de datos Adquiera al menos 500 000 eventos (linfocitos y monocitos). Se requiere una estrategia de selección secuencial para un análisis de datos exitoso: 1. Seleccione con precisión los linfocitos y monocitos utilizando perfiles de dispersión. 2. Observe el perfil Lin-1 frente a HLA-DR de los linfocitos y monocitos seleccionados y seleccione la población Lin-1-negativa, HLA-DR-positiva (R2 en la figura). Asegúrese de no incluir ninguna de las células Lin-1-positivas. 3. Observe el perfil IFN- versus CD123 de las células seleccionadas para detectar la población IFN- -positiva. La muestra no estimulada se usa como control negativo que también podría usarse para establecer los marcadores. Abra la segunda puerta en Lin-1- HLA-DR+(R2) y desde allí abra la tercera puerta para CD123+ IFN-alfa+(R3). Adquiera alrededor de 150-200 eventos en el cuadrante doble positivo CD123+ IFN-alfa+ (R3). Vea a continuación ejemplos de selección correctos e incorrectos. La selección correcta para IFN-alfa es crucial para un análisis correcto. A continuación se muestran dos ejemplos. El primer ejemplo es cómo recomendamos la selección para una detección adecuada de IFN-alfa. El segundo ejemplo es la forma incorrecta de seleccionar IFN-alfa.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). Se debe usar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Los conjugados de anticuerpos colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® en este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analitos. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están protegidos por patentes en trámite y concedidas. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se obtiene con la misma configuración instrumental que para la aloficocianina (APC). Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración instrumental adecuada, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources.