BD, 560097, BD Pharmingen™ PE Ratón anti-IFN-α[2b] humano

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: IFN-α2b humano
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado rutinariamente)
Vol. por prueba: 20 µl
ID de registro: AB_1645511
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y la PE libre. Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROCEDIMIENTO Consulte la tabla en la sección Productos complementarios sugeridos para conocer los nombres y las fuentes de los materiales utilizados en el siguiente protocolo Activación celular Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse en la campana utilizando una técnica aséptica. 1. Aísle células mononucleares de sangre periférica humana frescas PBMC de 60 ml de sangre fresca y lave 2X con PBS estéril 1 X. Centrifugue las células a 250 Xg durante 10 minutos y deseche el sobrenadante. 2. Suspenda las células en medio completo (RPMI suplementado con 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina y 10% FBS). Cuente y ajuste la concentración celular a 2-3 millones de células/ml. 3. Etiquete dos tubos cónicos estériles de 50 ml como "No estimulado" y "Estimulado con CPG". Dispense PBMC a cada tubo (2 millones de células/ml). 4. Añada 5 µg de oligodesoxinucleótido CPG por ml de células al tubo "Estimulado con CPG". Tape el tubo y agite suavemente en vórtex. 5. Incube ambos tubos durante 2 horas a 37 °C. 6. Diluya BD FastImmune™ Brefeldina A (BFA) 1 a 10 en PBS estéril 1X. 7. Añada 20 µl de BFA 1X por ml a ambos tubos (estimulado y no estimulado). Incube los tubos a 37 °C durante 2 horas. Nota: Mantenga las alícuotas de CPG y BFA a -20 °C. 8. Añada 100 µl de EDTA 20 mM por ml de células a ambos tubos e incube durante la noche a 4 °C. Tinción superficial e intracelular. 9. Centrifugue los dos tubos a 250 X g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes por aspiración y resuspenda las células en 25 ml de tampón de lavado FACS BD 10. Centrifugue los tubos a 250 X g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes y resuspenda las células en tampón de lavado FACS a 20 millones de células/ml. 11. Etiquete adecuadamente los tubos de polipropileno de 12x75 mm. Agregue 100 µl de células (2 millones de células/prueba) a cada tubo. 12. Agregue anticuerpos de tinción de superficie a cada tubo (Lin-1 FITC humano, CD123 PerCPCy5.5 humano y conjugado HLA-DR APC o PE humano). Incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. 13. Después de la incubación, agregue 2 ml de tampón de lavado FACS frío a cada tubo y centrifugue a 250 X g durante 10 minutos. Deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets para resuspender las células. 14. Añada 1 ml de tampón BD Cytofix/Cytoperm a temperatura ambiente a cada tubo. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos. 15. Añada 2 ml de tampón BD Perm/Wash frío a cada tubo y centrifugue a 500 X g durante 5 minutos; deseche los sobrenadantes por aspiración y agite los pellets para resuspender las células. 16. Añada el anticuerpo de tinción intracelular anti-IFN-alfa humano (20 µl/prueba) o el control de isotipo adecuado en el volumen apropiado por prueba a los tubos y mezcle bien por agitación. Lleve el volumen de prueba a 100 µl usando tampón BD Perm/Wash frío. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 60 minutos en oscuridad. 17. Añada 2 ml de tampón de lavado/permanente BD frío a cada tubo y centrifugue a 500 X g durante 5 minutos; deseche el sobrenadante por aspiración y agite el pellet en vórtex para suspender las células. 18. Añada 300 µl de tampón de lavado/permanente BD frío a cada tubo para un análisis citométrico de flujo inmediato. Opcional: vuelva a suspender los pellets con 200 µl de formaldehído frío al 1 % y mantenga los tubos a 4 °C en la oscuridad hasta 24 horas antes de la citometría de flujo. Si se almacenan durante más de 24 horas, recomendamos lavar las células en tampón de lavado, ya que la incubación prolongada con fijadores podría afectar a los fluorocromos. Citometría de flujo y análisis de datos Adquiera al menos 500 000 eventos (linfocitos y monocitos). Se requiere una estrategia de selección secuencial para un análisis de datos exitoso: 1. Seleccione con precisión los linfocitos y monocitos utilizando perfiles de dispersión. 2. Observe el perfil Lin-1 versus HLA-DR de los linfocitos y monocitos seleccionados, y seleccione la población Lin-1-negativa, HLA-DR-positiva (R2 en la figura). Asegúrese de no incluir ninguna de las células Lin-1-positivas. 3. Observe el perfil IFN- versus CD123 de las células seleccionadas para detectar la población IFN- -positiva. La muestra no estimulada se utiliza como control negativo que también podría usarse para establecer los marcadores. Abra la segunda puerta en Lin-1- HLA-DR+(R2) y desde allí abra la tercera puerta para CD123+ IFN-alfa+(R3). Adquiera alrededor de 150-200 eventos en el cuadrante doble positivo CD123+ IFN-alfa+ (R3). Vea a continuación ejemplos de selección correcta e incorrecta. La selección correcta para IFN-alfa es crucial para un análisis correcto. A continuación se muestran dos ejemplos. El primer ejemplo es cómo recomendamos la selección para una detección adecuada de IFN-alfa. El segundo ejemplo es la forma incorrecta de activar el IFN-alfa.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Para obtener espectros de fluorocromo y configuraciones adecuadas del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos.