BD, 560132, Kit de tinción BD Pharmingen™ FoxP3 Alexa Fluor® 647

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2737607
Descripción: Descripción El kit de tinción FoxP3 - Alexa Fluor® 647, FoxP3, CD4, CD25 proporciona tampones de fijación y permeabilización celular y anticuerpos fluorescentes que se unen específicamente a FoxP3, CD4 y CD25 humanos. El kit permite la tinción multicolor y el análisis citométrico de flujo de células humanas para sus patrones de expresión de CD4 y CD25 en la superficie celular y FoxP3 intracelular. El kit incluye el anticuerpo Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Human FoxP3 (Cat No. 560045) que se une específicamente a todas las isoformas actualmente identificadas del factor de transcripción FoxP3 humano, un miembro de la familia de factores de transcripción forkhead o winged helix. Se ha descubierto que la expresión de FoxP3, también conocido como Scurfin, IPEX y JM2, está asociada con las células T reguladoras CD4+ y representa un marcador específico para estas células. El análisis de citometría de flujo ha demostrado que FoxP3 se expresa en la mayoría de los linfocitos T CD4+CD25+high en sangre periférica, mientras que menos de la mitad de la población de linfocitos CD4+CD25int son positivos para FoxP3. Aproximadamente entre el 5 % y el 10 % de los linfocitos CD4+ periféricos son linfocitos T reguladores CD4+CD25+. Se cree que estos linfocitos desempeñan un papel crucial en el control de la autoinmunidad mediada por linfocitos T, al suprimir la proliferación y la producción de citocinas de otros linfocitos T. Para respaldar esta hipótesis, se ha descubierto que Foxp3 está mutado en ratones scurfy (sf).
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación celular y procedimientos de tinción para el anticuerpo anti-FoxP3 humano conjugado 1. Deje los tampones a temperatura ambiente (TA) antes de usar. Prepare soluciones de trabajo del juego de tampones BD Pharmingen™ Human FoxP3, n.º de cat. 560098 (para la preparación del tampón, consulte las instrucciones del tampón TDS, n.º de cat. 560098 para obtener más información). 2. Prepare una suspensión de células mononucleares de sangre periférica humana. Suspenda las células con tampón de tinción BD Pharmingen (FBS) (n.º de cat. 554656)* hasta diez millones de células/ml. 3. Pipetee la cantidad apropiada de reactivo de tinción de superficie en el fondo de cada tubo de 12 x 75 mm. 4. Añada 100 µl de células por tubo, agite en vórtex e incube durante 20 minutos a TA protegido de la luz. 5. Añada 2 ml de tampón de lavado. Centrifugue 250 g durante 10 minutos y retire el tampón de lavado. 6. Para fijar las células, resuspenda suavemente el pellet celular en el volumen residual del tampón de lavado y luego agregue 2 ml de tampón A 1x Human FoxP3. Agite en vórtex. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 7. Centrifugue 500 g durante 5 minutos y retire el fijador. Precaución: Tenga en cuenta que el pellet celular flota. 8. Para lavar las células, resuspenda cada pellet celular en 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)* y centrifugue 500 g durante 5 minutos. Retire el tampón de lavado. 9. Para permeabilizar las células, resuspenda suavemente el pellet celular en el volumen residual del tampón de lavado y luego agregue 0,5 ml de solución de trabajo 1x Human FoxP3 Buffer C a cada tubo. Agite en vórtex. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. 10. Para lavar las células, añadir 2 ml de tampón de tinción BD Pharmingen (FBS)* a cada tubo, centrifugar 500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retirar el tampón y repetir el paso de lavado. Retirar el tampón. 11. Añadir el anticuerpo FoxP3 conjugado en las concentraciones adecuadas para resuspender el sedimento celular. Agitar suavemente o mezclar con vórtex. 12. Incubar durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. 13. Repetir el paso de lavado n.º 10. 14. Resuspender en el tampón de lavado y analizar inmediatamente. Opcional: añadir 300 µl de formaldehído al 1 % en PBS 1x y almacenar a 4 °C. Analizar las células en un plazo de 2 horas. * Se recomienda utilizar el tampón de tinción BD Pharmingen (FBS; n.º de cat. 554656) para todos los pasos de lavado y cubrir los tubos durante los pasos de incubación con tapas o Parafilm®. También recomendamos optimizar los voltajes de dispersión frontal y lateral para visualizar los linfocitos separados de los restos, los fantasmas de glóbulos rojos y/o las plaquetas antes de la adquisición. ** Adquiera al menos entre 15 000 y 25 000 eventos de linfocitos CD4 positivos seleccionados.
Avisos del producto: Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.