BD, 560209, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 647 Anti-BrdU de ratón

Nombre alternativo: 5-bromo-2'-desoxiuridina, 5-bromouracilo desoxirribosido, BUdR
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Aplicación: Bioimagen (Probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645615
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Las células se marcan con pulsos de BrdU, se fijan para mantener la carga de BrdU y se permeabilizan para la tinción intranuclear del BrdU incorporado. Se utiliza DNasa I para escindir aleatoriamente el ADN, lo que permite que el anticuerpo monoclonal anti-BrdU se una al BrdU incorporado. Materiales • Cultivo celular adherente en crecimiento en una placa de imágenes Falcon™ de 96 pocillos • Incubadora a 37 °C • BrdU (n.º de cat. 550891) diluido a 10-100 μ M en medio de cultivo tisular, prepare suficiente para usar a 50 μ l por pocillo (consulte el paso 1 del procedimiento) • Tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655), calentado a 37 °C • Tampón de permeación BD™ Phosflow III (n.º de cat. 558050), a -20 °C • Solución salina tamponada con fosfato (PBS), a temperatura ambiente • Tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656), a 4 °C • Solución estéril de 300 μ g/ml de ADNasa I (preferiblemente, Sigma-Aldrich n.º de cat. D4513) en PBS, prepare suficiente para usar a razón de 50 μl por pocillo. • Anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU Alexa Fluor® 647 diluido 1:10 en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), prepare suficiente para usar a razón de 50 μl por pocillo. Si se van a usar anticuerpos adicionales, agréguelos de forma que todos los anticuerpos estén incluidos en los 50 μl por pocillo. • Solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (p. ej., Sigma-Aldrich Cat. No. B2261) en PBS, prepare suficiente para usar a 100 μl por pocillo • Instrumento de imágenes de fluorescencia capaz de excitar Alexa Fluor® 647 y Hoechst 33342, como el sistema de bioimágenes BD Pathway™ Procedimiento 1. Pulse los cultivos celulares adherentes añadiendo 50 μl de BrdU diluido a cada pocillo e incubando durante 1-2 horas a 37 °C. Omita la BrdU de los pocillos que se utilizarán como controles negativos para la tinción de BrdU. En todos los pasos posteriores, las células cargadas con BrdU y las células de control deben procesarse en paralelo. 2. Retire el medio de los pocillos y fije las células añadiendo 100 μl del tampón de fijación precalentado a cada pocillo e incubándolos durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. 3. Retire el fijador de los pocillos y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 4. Retire el PBS y permeabilice las células añadiendo 100 μl de BD™ Phosflow Perm Buffer III helado a cada pocillo e incubándolos durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Retire el Perm Buffer III de los pocillos y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 6. OPCIONAL: Retire el PBS y bloquee las células añadiendo 100 μl de BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) a cada pocillo e incubándolos durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 7. Retire el tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) y desnaturalice el ADN de las células añadiendo 50 μl de solución estéril de DNasa I a cada pocillo e incubándolo durante 1 hora a 37 °C. 8. Retire la solución de DNasa I de los pocillos y lávelos una vez con 100 μl de PBS. 9. Retire el PBS y tiña las células añadiendo 50 μl de solución de anticuerpo diluido a cada pocillo e incubándolo durante 1 hora a temperatura ambiente. 10. Retire la solución de anticuerpo y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 11. Retire el PBS y contratine los núcleos añadiendo 100 μl de solución Hoechst 33342 a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la obtención de imágenes. 12. Observe y analice las células en un instrumento de obtención de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los analizadores de células BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 620/60 700/75 660 LP BD Pathway 435 628/40 690/40 FF660
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso en el volumen recomendado por prueba cuando se sigue el procedimiento de ensayo recomendado. Una prueba es típicamente ~10,000 células cultivadas en un pocillo de una placa de imágenes de 96 pocillos. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos de colorante Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® en este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analito. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están protegidos por patentes en trámite y emitidas. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se obtiene con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.