BD, 560218, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 555 Anti-SSEA-4 de ratón

Nombre alternativo: Antígeno embrionario específico de estadio 4
Reactividad: Humana (prueba de control de calidad), Ratón (reportada)
Isotipo: Ratón BALB/c IgG3, κ
Inmunógeno: Línea celular de teratocarcinoma humano
Aplicación: Bioimagen (Probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645389
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 555 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 555 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados 1. Siembre las células en un medio de cultivo apropiado a una densidad celular apropiada en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353219) y cultive durante la noche a 48 horas. 2. Retire el medio de cultivo de los pocillos y lave (una o dos veces) con 100 μl de PBS 1×. 3. Fije las células añadiendo 100 µl de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS o tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655) a cada pocillo e incubándolo durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). 4. Retire el fijador de los pocillos y lave los pocillos (una o dos veces) con 100 μl de PBS 1×. 5. Permeabilice las células con metanol frío (a), Triton™ X-100 (b) o saponina (c): a. Añada 100 µl de metanol al 90 % a -20 °C o tampón de permeación BD™ Phosflow III a -20 °C (n.º de cat. 558050) a cada pocillo e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. b. Añada 100 µl de Triton™ X-100 al 0,1 % a cada pocillo e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. c. Añada 100 µl de tampón de permeación/lavado 1× (n.º de cat. 554723) a cada pocillo e incube de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Continúe utilizando tampón de permeación/lavado 1× en todos los lavados y diluciones posteriores. 6. Retire el tampón de permeabilización de los pocillos y lave una o dos veces con 100 μl del tampón adecuado (ya sea PBS 1× o tampón de permeabilización/lavado 1×, consulte el paso 5.c.). 7. Paso de bloqueo opcional: Retire los tampones de lavado y bloquee las células añadiendo 100 µl de tampón de bloqueo BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (n.º de cat. 554656) o FBS al 3 % en el tampón de dilución adecuado a cada pocillo e incubando de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Diluya el anticuerpo a su concentración de trabajo óptima en el tampón de dilución adecuado. Titule los anticuerpos purificados (no conjugados) y los reactivos del segundo paso para determinar la concentración óptima. Si utiliza un conjugado de anticuerpos Bioimaging Certified, dilúyalo 1:10. 9. Añada 50 µl de anticuerpo diluido por pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Incubar en la oscuridad si se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia. 10. Retirar el anticuerpo y lavar los pocillos tres veces con 100 μl de tampón de lavado. Se puede incluir un lavado con detergente opcional (100 μl de Tween al 0,05 % en PBS 1×) antes de los pasos de lavado habituales. 11. Si el anticuerpo que se utiliza está marcado con fluorescencia, pasar al paso 12. De lo contrario, si se utiliza un anticuerpo purificado sin marcar, repetir los pasos 8 a 10 con un reactivo de segundo paso marcado con fluorescencia para detectar el anticuerpo purificado. 12. Después del lavado final, contrateñir los núcleos añadiendo 100 μl de una solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (p. ej., Sigma-Aldrich Cat. No. B2261) en PBS 1× a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la obtención de imágenes. 13. Ver y analizar las células en un instrumento de obtención de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los instrumentos BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 548/20 570LP Fura/FITC BD Pathway 435 543/22 593/40 FF562
Avisos del producto: Avisos del producto Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba cuando se sigue el procedimiento de ensayo recomendado. Una prueba suele consistir en ~10 000 células cultivadas en un pocillo de una placa de imágenes de 96 pocillos. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Triton es una marca comercial de Dow Chemical Company. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Los conjugados de anticuerpos Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® de este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. exclusivamente para uso en investigación, excluyendo su uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos para analitos. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están protegidos por patentes en trámite y emitidas. La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se obtiene con la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors.