BD, 560327, BD Pharmingen™ Anti-GATA4 de ratón purificado

Nombre alternativo: MGC126629, GATA-4
Reactividad: Ratón (prueba de control de calidad), humano (reportado)
Isotipo: Ratón BALB/c IgG1, κ
Inmunógeno: péptido GATA4 humano
Aplicación: Western blot (probado rutinariamente), bioimagen (probado durante el desarrollo)
Peso molecular objetivo: 42 - 50 kDa
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_1645188
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Para obtener más información, consulte: http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Western_Blotting.shtml y Bioimaging: http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Bioimaging_Certified.shtml Protocolo recomendado para Bioimaging: 1. Siembre las células en un medio de cultivo apropiado a una densidad celular apropiada en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353219) y cultive durante la noche a 48 horas. 2. Retire el medio de cultivo de los pocillos y lave (una o dos veces) con 100 μl de PBS 1×. 3. Fije las células añadiendo 100 µl de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS o tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655) a cada pocillo e incubándolos durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). 4. Retire el fijador de los pocillos y lávelos (una o dos veces) con 100 µl de PBS 1×. 5. Permeabilice las células utilizando metanol frío (a), Triton™ X-100 (b) o saponina (c): a. Añada 100 µl de metanol al 90 % a -20 °C o tampón de permeación BD™ Phosflow III a -20 °C (n.º de cat. 558050) a cada pocillo e incube durante 5 minutos a TA. b. Añadir 100 µl de Triton™ X-100 al 0,1 % a cada pocillo e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. c. Añadir 100 µl de tampón de permeabilización/lavado 1× (n.º de cat. 554723) a cada pocillo e incubar de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Seguir utilizando el tampón de permeabilización/lavado 1× en todos los lavados y diluciones posteriores. 6. Retirar el tampón de permeabilización de los pocillos y lavar una o dos veces con 100 µl del tampón adecuado (PBS 1× o tampón de permeabilización/lavado 1×; véase el paso 5.c). 7. Paso de bloqueo opcional: Retire los tampones de lavado y bloquee las células añadiendo 100 µl de tampón de bloqueo BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (n.º de cat. 554656) o FBS al 3 % en el tampón de dilución adecuado a cada pocillo e incubando de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Diluya el anticuerpo hasta su concentración de trabajo óptima en el tampón de dilución adecuado. Titule los anticuerpos purificados (no conjugados) y los reactivos del segundo paso para determinar la concentración óptima. Si utiliza un conjugado de anticuerpo certificado por Bioimaging, dilúyalo 1:10. 9. Añada 50 µl de anticuerpo diluido por pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Incube en la oscuridad si utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia. 10. Retire el anticuerpo y lave los pocillos tres veces con 100 µl de tampón de lavado. Un lavado con detergente opcional (100 μl de Tween al 0,05 % en PBS 1×) se puede incluir antes de los pasos de lavado regulares. 11. Si el anticuerpo que se está utilizando está marcado con fluorescencia, entonces vaya al paso 12. De lo contrario, si utiliza un anticuerpo purificado sin marcar, repita los pasos 8 a 10 con un reactivo de segundo paso marcado con fluorescencia para detectar el anticuerpo purificado. 12. Después del lavado final, contratine los núcleos añadiendo 100 μl de una solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (p. ej., Sigma-Aldrich Cat. No. B2261) en PBS 1× a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la obtención de imágenes. 13. Visualice y analice las células en un instrumento de obtención de imágenes adecuado. Procedimiento de ensayo recomendado para secciones de tejido: 1. Coseche los órganos o tejidos diana y enjuague con PBS. 2. Coloque los tejidos en casetes y fíjelos con formalina tamponada neutra al 10 % (Fisher SF100-4) durante 16 horas. 3. Retire el fijador y proceda con el procesamiento y la inclusión en parafina utilizando protocolos estándar.* 4. Corte secciones de tejido incluidas en parafina (5 µm) utilizando un micrótomo, adhiera las secciones a portaobjetos colorfrost (Fisher 12-550-17) y déjelos secar al aire.* 5. Desparafine y rehidrate las secciones.* 6. Trátelos con solución BD Retrievagen A (n.º de cat. 550524) calentando los portaobjetos en una olla a presión a 121 °C durante 15 minutos a 17 psi.* 7. Deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente en el Retrievagen A, enjuáguelos con agua del grifo y guárdelos en PBS antes de la tinción con anticuerpos. 8. Las secciones pueden teñirse simultáneamente con una mezcla de múltiples anticuerpos a la concentración preoptimizada, durante 2 horas a temperatura ambiente. 9. Lavar las secciones con PBS 1×. 10. Si es necesario, marcar el ADN celular con 2 µg/ml de Hoechst 33342 durante 30 minutos y lavar con PBS 1×. 11. Colocar cubreobjetos sobre las secciones utilizando Aqua-Mount (Lerner Labs 13800). 12. Visualizar y analizar las muestras en un instrumento de imagenología adecuado, como el sistema de bioimagenología de alto contenido BD Pathway™ 435. * Para más información, consulte http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Paraffin_Sections.shtml
Avisos del producto: Debido a que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Este anticuerpo ha sido desarrollado y certificado para aplicaciones de bioimagen. Sin embargo, no se realiza una prueba de bioimagen de rutina en todos los lotes. Se recomienda a los investigadores titular el reactivo para obtener un rendimiento óptimo. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Triton es una marca registrada de Dow Chemical Company.