BD, 560429, BD™ Matriz de perlas citométricas (CBA) TGF-β1 humano, conjunto flexible de un solo plexo

Rango de ensayo: 40-10 000 pg/mL
Reactividad: Humana (prueba de control de calidad), Ratón, Rata, Cerdo, Vaca (reportada)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869346
Descripción: Descripción El BD™ Human TGF-β1 Flex Set es un inmunoensayo basado en microesferas capaz de medir el TGF-β1 humano soluble en muestras de suero y sobrenadante de cultivos celulares. La reactividad humana se determinó analizando muestras con el BD CBA Human TGF-β1 Flex Set. La biología y la función del TGF-β1 se han revisado extensamente en la literatura. El BD CBA Human TGF-β1 Flex Set es un ensayo de plexo único. El BD CBA HumanTGF-β1 Flex Set no debe utilizarse con lo siguiente: - BD CBA Human, Mouse or Rat Soluble Protein Flex Sets - BD CBA Cell Signaling Flex Sets - BD CBA Human Soluble Receptor Protein Flex Sets - BD CBA Human Immunoglobulin Flex Sets - Ensayos basados ​​en microesferas que no sean BD Nota: No se recomiendan muestras de plasma con este ensayo.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación del reactivo de activación de TGF-β1 Los siguientes reactivos son necesarios para activar el TGF-β1 latente a su forma inmunorreactiva: Reactivos para muestras de sobrenadante de cultivo celular 1. HCl 1 N (100 ml): a 91,67 ml de agua desionizada, agregue lentamente 8,33 ml de HCl 12 N. Mezcle bien. 2. NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M (100 ml): a 75 ml de agua desionizada, agregue lentamente 12 ml de NaOH 10 N. Mezcle bien. Agregue 11,9 g de HEPES. Mezcle bien. Lleve el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Reactivos para muestras de suero 1. Ácido acético 2,5 N/urea 8 M (100 ml): a 40 ml de agua desionizada, agregue lentamente 48,1 g de urea. Mezclar hasta que se disuelva. Agregar lentamente 14,4 mL de ácido acético glacial. Mezclar bien. Llevar el volumen final a 100 mL con agua desionizada. 2. 2,7 N NaOH/1 M HEPES (100 mL) - A 56 mL de agua desionizada, agregar lentamente 27 mL de 10 N NaOH. Mezclar bien. Agregar 23,8 g de HEPES. Mezclar bien. Llevar el volumen final a 100 mL con agua desionizada. Activación de la muestra de TGF-β1 Para activar el TGF-β1 latente a su forma inmunorreactiva, las muestras deben acidificarse a pH 3,0 o inferior durante un período de tiempo y neutralizarse de nuevo a pH 7,2 - 7,6 antes de la prueba. Usar tubos de polipropileno. No activar el estándar Flex Set. Las diluciones recomendadas son una guía, puede requerirse optimización. Activación de muestras de sobrenadante de cultivo celular 1. Agregar 0,1 mL de HCl 1 N a 0,5 mL de muestra y mezclar bien. 2. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Neutralizar agregando 0,1 mL de NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M y mezclar bien. 4. La muestra ya está lista para la prueba. 5. La concentración calculada de las muestras procesadas en el ensayo debe multiplicarse por un factor de dilución de 1,4. Activación de muestras de suero 1. Agregar 0,1 mL de ácido acético 2,5 N/urea 8 M a 0,1 mL de muestra y mezclar bien. 2. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Neutralizar agregando 0,1 mL de NaOH 2,7 N/HEPES 1 M y mezclar bien. 4. Diluir las muestras de suero 10 veces con diluyente de ensayo antes de realizar el ensayo. 5. La concentración calculada de las muestras procesadas en el ensayo debe multiplicarse por un factor de dilución de 30. Nota: El TGF-β1 está altamente conservado entre las especies y este ensayo reacciona de forma cruzada con múltiples especies, incluyendo ratón, rata, bovino y porcino. Por lo tanto, se debe esperar que el medio acondicionado que contiene suero de mamífero (cuando se acidifica) tenga un nivel de fondo significativo de TGF-β1, que puede variar dependiendo de la especie del suero, el lote y el porcentaje de suero utilizado. Hay varias maneras de tratar con este nivel de fondo de TGF-β1: 1. Determine el nivel de fondo de TGF-β1 solo en el medio de cultivo y réstelo de los valores de la muestra. 2. Use medio sin suero de mamífero para el cultivo celular. 3. Cambie a medio sin suero durante el período de tiempo deseado antes de recolectar las muestras. Preparación del estándar BD CBA Human TGF-β1 Flex Set Será necesario preparar una curva estándar. El protocolo a continuación indica cómo debe diluirse el estándar para su uso en un kit flexible BD CBA Human TGF-β1. Siga las instrucciones a continuación, ya que difieren de las proporcionadas en el manual del kit maestro de tampón de proteína soluble humana. Conserve el estándar liofilizado y los demás componentes a 4 °C. 1. Abra un vial de estándar liofilizado. 2. Transfiera la esfera del estándar liofilizado a un tubo de polipropileno. Etiquete el tubo como "Estándar superior". Se recomienda encarecidamente a los investigadores transferir el estándar liofilizado al tubo de polipropileno para su reconstitución, ya que otros métodos pueden aumentar la variabilidad. 4. Reconstituya el estándar con 1,0 ml de diluyente de ensayo. Deje que el estándar reconstituido se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar las diluciones. Mezcle la proteína reconstituida solo con una pipeta. No agite en vórtex ni mezcle vigorosamente. Al reconstituirse en 1,0 ml de diluyente de ensayo, el estándar tiene una concentración de proteína de 10 000 pg/ml. Deseche el estándar reconstituido no utilizado, no lo almacene ni lo reutilice. 5. Etiquete 12 tubos de 75 mm y colóquelos en el siguiente orden: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 y 1:256. 6. Pipetee 500 μL de diluyente de ensayo a cada uno de los tubos restantes. 7. Realice una dilución en serie transfiriendo 500 μL del estándar superior al tubo de dilución 1:2 y mezcle bien (mezcle solo con la pipeta, no agite en vórtex). Continúe haciendo diluciones en serie transfiriendo 500 μL del tubo 1:2 al tubo 1:4 y así sucesivamente hasta el tubo 1:256. Prepare un tubo que contenga diluyente de ensayo para que sirva como control negativo de 0 pg/mL. 8. Se recomienda que los primeros diez pocillos o tubos del experimento sean los estándares. Los estándares se deben procesar en orden desde el menos concentrado (0 pg/ml) hasta el más concentrado (estándar superior). Preparación de las perlas de captura del juego flexible BD CBA Human TGF-β1 Las perlas de captura proporcionadas en el juego flexible BD CBA Human TGF-β1 tienen una concentración de 50× y se deben diluir hasta su concentración óptima en el tampón de diluyente de perlas de captura antes de agregarlas a un tubo de ensayo o pocillo de ensayo determinado. El diluyente de perlas de captura para suero/plasma proporcionado en el kit de tampón maestro de proteína soluble humana no se utiliza en este ensayo, incluso si se analizan muestras de suero. 1. Determine el número de pruebas en el experimento. Se recomienda que el usuario prepare algunas pruebas adicionales a las que usará en el experimento para asegurarse de que haya suficiente material preparado para el experimento. 2. Agite en vórtex el vial de stock de perlas de captura durante al menos 15 segundos para resuspender las perlas completamente. 3. Determine el volumen total de perlas diluidas necesarias para el experimento. Cada tubo/pocillo requiere 50 μL de perlas diluidas. El volumen total de perlas diluidas se puede calcular multiplicando el número de pruebas (determinado en el paso 1) por 50 μL. 4. Determine el volumen necesario para las perlas de captura. Las perlas se suministran de forma que 1,0 μL = 1 prueba. Por lo tanto, el volumen requerido (μL) de perlas es igual al número de pruebas. 5. Determine el volumen de diluyente de perlas de captura necesario para diluir las perlas. El volumen de diluyente de perlas de captura se puede calcular restando el volumen de perlas del volumen total de perlas diluidas necesarias para realizar el ensayo. 6. Pipetee las perlas de captura y el diluyente de perlas de captura en un tubo etiquetado como "Perlas de captura diluidas". Preparación del reactivo de detección de PE del BD CBA Human TGF-β1 Flex Set El reactivo de detección de PE proporcionado con el BD CBA Human TGF-β1 Flex Set es un volumen 50× (1 μl/prueba) y debe diluirse a su volumen óptimo por prueba (50 μl/prueba) antes de agregar el reactivo de detección de PE a un tubo o pocillo de ensayo determinado. Nota: Proteja el reactivo de detección de PE de la exposición a la luz directa porque puede fotoblanquearse y perderá intensidad de fluorescencia. 1. Determine el número de pruebas que se realizarán en el experimento. Se recomienda que el usuario prepare algunas pruebas adicionales a las que usará en el experimento para asegurarse de que haya suficiente material preparado para el experimento. 2. Determine el volumen total de reactivo de detección de PE diluido necesario para el experimento. Cada tubo/pocillo requiere 50 μL del reactivo de detección de PE diluido. El volumen total de PE diluido se puede calcular multiplicando el número de pruebas (determinado anteriormente). 3. Determine el volumen necesario del reactivo de detección de TGF-β1 PE. El reactivo de detección de PE se suministra de forma que 1,0 μL = 1 prueba. Por lo tanto, el volumen requerido (μL) de reactivo de detección de PE es igual al número de pruebas. 4. Determine el volumen de diluyente del reactivo de detección necesario para diluir los reactivos de detección de PE. El volumen de diluyente del reactivo de detección se puede calcular restando el volumen del reactivo de detección de TGF-β1 PE analizado del volumen total de PE diluido necesario. 5. Pipetee el reactivo de detección y el diluyente del reactivo de detección en un tubo etiquetado como "Reactivo de detección de TGF-β1 PE". Conservar a 4 °C, protegido de la luz, hasta su uso. Procedimiento del ensayo BD CBA Human TGF-β1 Flex Set Después de la preparación y dilución de los componentes individuales del ensayo, transfiera los estándares o muestras, las perlas de captura y los reactivos de detección de PE a los pocillos o tubos de ensayo adecuados para la incubación y el análisis. Siga las instrucciones a continuación, ya que pueden diferir de las proporcionadas en el manual del kit de tampón maestro de proteína soluble humana. Los investigadores deben tener en cuenta que, en algunos casos, puede necesitarse tampón de lavado adicional, que puede adquirirse por separado (n.º de cat. 560105). Nota: Proteja las perlas de captura y los reactivos de detección de PE de la exposición directa a la luz. Para placas: 1. Prepare todos los reactivos como se describe en las secciones anteriores antes de comenzar el experimento. 2. Humedezca previamente la placa añadiendo 100 μL de tampón de lavado a cada pocillo. Para eliminar el exceso de volumen, aplíquelo al colector de vacío. No exceda 10" Hg de presión de vacío. Aspire hasta que los pocillos se drenen (2 a 10 segundos). 3. Agite en vórtex las perlas de captura diluidas durante al menos 5 segundos. Agregue 50 μL de las perlas de captura diluidas a cada pocillo de ensayo. 4. Agregue 50 μL de estándar o muestras a los pocillos de ensayo. 5. Mezcle la placa durante 5 minutos usando un agitador digital a 500 RPM (no exceda 600 RPM) e incube la placa durante 2 horas a TA. 6. Coloque la placa en el colector de vacío y aspire al vacío (no exceda 10" Hg de presión de vacío) hasta que los pocillos se drenen (2 a 10 segundos). 7. Agregue 50 μL del reactivo de detección de PE diluido a cada pocillo de ensayo. 8. Mezcle la placa durante 5 minutos usando un agitador digital a 500 RPM e incube la placa a TA durante 2 horas. 9. Coloque la placa en el colector de vacío y aspire al vacío (no exceda 10" Hg de presión de vacío) hasta que los pocillos se drenen (2 a 10 segundos). 10. Agregue 150 μL de tampón de lavado a cada pocillo de ensayo. 11. Coloque la placa en el colector de vacío y aspire al vacío (no exceda 10" Hg de presión de vacío) hasta que los pocillos se drenen (2 a 10 segundos). 12. Agregue 150 μL de tampón de lavado a cada pocillo de ensayo. Agite la microplaca en un agitador digital a 500 RPM durante 5 minutos para resuspender las microesferas. 13. Comience a analizar las muestras en un citómetro de flujo. Nota: Es mejor analizar las muestras el día del experimento. El almacenamiento prolongado de las muestras, una vez finalizado el ensayo, puede provocar un aumento del fondo y una reducción de la sensibilidad. Para los tubos: 1. Prepare todos los reactivos como se describe en las secciones anteriores antes de comenzar el experimento. 2. Agite en vórtex las perlas de captura diluidas durante al menos 5 segundos. Añada 50 μL de las perlas de captura diluidas a cada tubo de ensayo. 3. Añada 50 μL de estándar o muestra a cada tubo de ensayo. 4. Mezcle suavemente los tubos de ensayo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 5. Añada 1,0 mL de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugue a 200 × g durante 5 minutos. 6. Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante de cada tubo de ensayo dejando aproximadamente 100 μL de líquido en cada tubo de ensayo. La aspiración debe realizarse de la forma más consistente posible. 7. Añada 50 μL del reactivo de detección de PE diluido a cada tubo de ensayo. 6. Mezcle suavemente los tubos de ensayo e incube durante 2 horas a temperatura ambiente. 8. Añada 1,0 mL de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugue a 200 × g durante 5 minutos. 9. Aspire cuidadosamente y deseche el sobrenadante de cada tubo de ensayo, dejando aproximadamente 100 μL de líquido en cada uno. La aspiración debe realizarse con la mayor consistencia posible. 10. Añada 300 μL de tampón de lavado a cada tubo de ensayo. Agite brevemente los tubos de ensayo para resuspender las microesferas. 11. Comience a analizar las muestras en un citómetro de flujo. Se recomienda agitar brevemente cada tubo antes de analizarlo en el citómetro de flujo. Nota: Es recomendable analizar las muestras el mismo día del experimento. El almacenamiento prolongado de las muestras, una vez finalizado el ensayo, puede provocar un aumento del fondo y una reducción de la sensibilidad. El kit flexible BD CBA Human TGF-β1 debe utilizarse junto con el kit de tampón maestro de proteína soluble humana BD CBA (n.° de cat. 558264, 100 pruebas, o 558265, 500 pruebas), un citómetro de flujo y el software FCAP Array™ (n.° de cat. 641488). El punto estándar superior del kit flexible BD CBA Human TGF-β1 será de 10 000 pg/ml. La Figura 1 muestra un ejemplo de curva estándar. Límite de detección: El límite de detección teórico es de 14,9 pg/ml y se determinó evaluando el resultado estimado del MFI promedio del control negativo (0 pg/ml, n = 30) + 2 desviaciones estándar. Mostrar menos
Avisos del producto: Avisos del producto La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Advertencia: El estándar liofilizado CBA contiene 0,02 % (p/p) de una mezcla CMIT/MIT (3:1), que es una mezcla de: 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 247-500-7] y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona [CE n.º 220-239-6] (3:1). Declaración de peligro: Puede causar una reacción alérgica en la piel. Declaraciones de precaución: La ropa de trabajo contaminada no debe salir del lugar de trabajo. Use guantes/protección ocular/facial. Use ropa protectora. Evite respirar la niebla, los vapores o el aerosol. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consulte a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con abundante agua. Quítese la ropa contaminada y lávela antes de volver a usarla. Deseche el contenido/el recipiente de acuerdo con la normativa local, regional, nacional e internacional. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Mostrar menos
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
N/D : 100.0 : N/D : N/D