BD, 560445, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 488 Anti-H2AX de ratón (pS139)

Nombre alternativo: H2A.X; H2A/X; H2AFX; HIST5-2AX; gamma-H2AX; γ-H2AX; H2AX (pS140)
Reactividad: Humana (prueba de control de calidad), Ratón (probado en desarrollo)
Isotipo: Ratón BALB/c IgG1, κ
Inmunógeno: péptido H2AX humano fosforilado
Aplicación: Bioimagen (probada rutinariamente), tinción intracelular (citometría de flujo) (probada durante el desarrollo)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645352
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 488 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 488 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Procedimiento de ensayo recomendado para bioimágenes: http://www.bdbiosciences.com/support/resources/protocols/ceritifed_reagents.jsp o http://www.bdbiosciences.com/bioimaging/reagents 1. Siembre las células en un medio de cultivo apropiado a una densidad celular apropiada en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353219) y cultive durante la noche a 48 horas. 2. Retire el medio de cultivo de los pocillos y lave (una o dos veces) con 100 μl de PBS 1×. 3. Fije las células añadiendo 100 µl de formaldehído fresco al 3,7 % en PBS o tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655) a cada pocillo e incubándolo durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). 4. Retire el fijador de los pocillos y lávelos (una o dos veces) con 100 µl de PBS 1×. 5. Permeabilice las células usando metanol frío (a), Triton™ X-100 (b) o saponina (c): a. Añada 100 µl de metanol al 90 % a -20 °C o tampón de permeación BD™ Phosflow III a -20 °C (n.º de cat. 558050) a cada pocillo e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. b. Añada 100 µl de Triton™ X-100 al 0,1 % a cada pocillo e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. c. Añada 100 µl de tampón de permeación/lavado 1× (n.º de cat. 554723) a cada pocillo e incube durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Continúe usando el tampón de permeabilización/lavado 1× para todos los pasos de lavado y dilución posteriores. 6. Retire el tampón de permeabilización de los pocillos y lave una o dos veces con 100 μl del tampón adecuado (ya sea 1× PBS o 1× tampón de permeabilización/lavado, consulte el paso 5.c.). 7. Paso de bloqueo opcional: Retire los tampones de lavado y bloquee las células añadiendo 100 µl de tampón de bloqueo BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (n.º de cat. 554656) o FBS al 3 % en el tampón de dilución adecuado a cada pocillo e incubando durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Diluya el anticuerpo a su concentración de trabajo óptima en el tampón de dilución adecuado. Titule los anticuerpos purificados (no conjugados) y los reactivos del segundo paso para determinar la concentración óptima. Si utiliza un conjugado de anticuerpo certificado por Bioimaging, dilúyalo 1:10. 9. Añada 50 µl de anticuerpo diluido por pocillo e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente. Si utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia, incube en oscuridad. 10. Retire el anticuerpo y lave los pocillos tres veces con 100 µl de tampón de lavado. Opcionalmente, puede añadir un lavado con detergente (100 µl de Tween al 0,05 % en PBS 1×) antes de los pasos de lavado habituales. 11. Si el anticuerpo utilizado está marcado con fluorescencia, continúe con el paso 12. De lo contrario, si utiliza un anticuerpo purificado sin marcar, repita los pasos 8 a 10 con un reactivo de segundo paso marcado con fluorescencia para detectar el anticuerpo purificado. 12. Tras el lavado final, realice una contratinción de los núcleos añadiendo 100 μl de una solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (p. ej., Sigma-Aldrich, n.º de cat. B2261) en PBS 1× a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la adquisición de imágenes. 13. Observe y analice las células en un instrumento de adquisición de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los instrumentos BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 488/10 515 LP Fura/FITC BD Pathway 435 482/35 536/40 FF506
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba cuando se sigue el procedimiento de ensayo recomendado. Una prueba es típicamente ~10,000 células cultivadas en un pocillo de una placa de imágenes de 96 pocillos. Los conjugados de anticuerpos de colorante Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® en este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analito. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), el colorante Pacific Blue™ y el colorante Cascade Blue® están cubiertos por patentes pendientes y emitidas. La emisión de fluorocromo Alexa Fluor® 488 se recolecta en la misma configuración del instrumento que para el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Para los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Triton es una marca registrada de Dow Chemical Company. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.