BD, 560746, Tampón de permanente BD Phosflow™ IV 10×

Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Conservar sin diluir a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Este es el protocolo estándar para permeabilizar leucocitos fijados con Perm Buffer IV para la tinción posterior de marcadores de superficie celular y proteínas de señalización fosforiladas. 1. Precaliente el tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655), para PBMC, o el tampón de lisis/fijación BD Phosflow™ (n.º de cat. 558049), para sangre completa o esplenocitos, a 37 °C antes de su uso. 2. Diluya el tampón de permeación IV a 1,0× utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1× antes de su uso. 3. Prepare las células. Utilice el paso a para PBMC o el paso b para sangre completa o esplenocitos. a. Aísle las PBMC mediante separación por gradiente de densidad (p. ej., utilizando el tubo de preparación de células BD Vacutainer® CPT con heparina sódica, n.º de cat. 362753) de sangre completa, lave bien las células y luego trátelas con el activador, inhibidor o combinaciones de estos que desee. Al final del tratamiento celular, mezcle inmediatamente un volumen del tampón de fijación BD Cytofix calentado con un volumen de las PBMC suspendidas. Mezcle bien e incube los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 10 a 15 minutos. Centrifugue las células a 400 g durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa. Aspire el sobrenadante. o b. Obtenga sangre completa o suspenda células del bazo. Trate las células (p. ej., 100 µL) con el activador o inhibidor que desee. Después del tratamiento, añada un exceso de volumen de 20 veces (p. ej., 2,0 ml) de tampón de lisis/fijación BD Phosflow™ calentado. Mezcle bien e incube los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 10 a 15 minutos. Centrifugue las células a 400 g durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa. Aspire el sobrenadante. 4. Lave los leucocitos fijados una vez con PBS. Sedimente las células mediante centrifugación a 400 g y retire todo el sobrenadante. Nota: Los grandes volúmenes residuales de sobrenadante que quedan después de los pasos de centrifugación y aspiración pueden diluir el Perm Buffer IV que se añade posteriormente. Esto puede dar lugar a perfiles de tinción deficientes. 5. Agite los tubos en vórtex para aflojar las células. Permeabilice las células añadiendo lentamente Perm Buffer IV gota a gota a las células. Añada aproximadamente 10 ml de Perm Buffer IV por cada 5 a 10 millones de células. Añada un mínimo de 1 ml de Perm Buffer IV para una concentración celular inferior a 5 millones de células. Incube a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Nota 1: Un tiempo de permeabilización más prolongado o el uso de una proporción de volumen de células a tampón fuera de la recomendada pueden resultar en una tinción y detección más deficientes de marcadores de superficie fluorescentes y/o anticuerpos específicos de proteínas fosforiladas. Nota 2: La permeabilización con Perm Buffer IV puede resultar en una menor recuperación celular. 6. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos y retirar el sobrenadante por aspiración. 7. Lavar dos veces añadiendo BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) a las células. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos y retirar el sobrenadante por aspiración cada vez. 8. Resuspender las células en BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) a 10 x 10^6 células/ml y alicuotar 100 µl en cada tubo de muestra para continuar con la tinción de anticuerpos y el análisis de citometría de flujo. Cabe destacar que si la tinción de marcadores de superficie celular tras la permeabilización celular con Perm Buffer IV no resulta eficaz, se pueden teñir previamente las células con anticuerpos fluorescentes dirigidos contra marcadores de superficie antes de la fijación celular o entre los pasos de fijación y permeabilización. La tinción puede realizarse entonces con anticuerpos específicos para moléculas de señalización intracelular fosforiladas.
Avisos del producto: Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS).