BD, 560752, Kit de fenotipado Th1/Th17 humano BD Pharmingen™

Aplicación: Citometría de flujo (probada durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869361
Descripción: Descripción Componentes: 51-9006617 Cóctel de fenotipado Th1/Th17 humano 1,0 ml Contiene lo siguiente: CD4 humano PerCP-Cy5.5 (clon: SK3) IL-17A PE humano (clon: N49-653) IFN-GMA FITC humano (clon: B27) 51-9006613 Tampón de fijación BD Cytofix™ 100 ml 51-2091KE Tampón BD Perm/Wash™ 25 ml 51-2092KZ Inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (que contiene monensina) 0,7 ml El grupo de células T CD4+ periféricas incluye múltiples subconjuntos de células T efectoras y de memoria que surgen a través de la expansión y diferenciación impulsadas por antígenos de células T vírgenes. La respuesta temprana de las células T CD4+ vírgenes a la estimulación antigénica se caracteriza por una proliferación de alto nivel y un repertorio limitado de citocinas. Una mayor diferenciación produce células con un potencial más diverso para la expresión de citocinas. Dependiendo del equilibrio de citocinas locales, moléculas coestimuladoras, niveles de antígenos y factores genéticos, las células T auxiliares de tipo 1 (Th1) y las células efectoras y/o de memoria Th17 son generadas por respuestas inmunitarias. Se han identificado subconjuntos de células T CD4+ funcionalmente polarizadas con base en sus patrones distintivos de secreción de citocinas. Como citocina característica, las células Th1 producen selectivamente grandes cantidades de interferón gamma (IFN-γ), mientras que las Th17 expresan altos niveles de IL-17A. A través de la secreción de IFN-γ y otras moléculas efectoras, las células Th1 activan macrófagos, células asesinas naturales (NK) y células T CD8+ y son responsables de la inmunidad mediada por células. Los linfocitos Th1 brindan protección contra bacterias, hongos, protozoos y virus intracelulares, y participan en algunas respuestas autoinmunitarias. Mediante la secreción de IL-17A y otros factores, los linfocitos Th17 reclutan y activan neutrófilos y median la respuesta inmunitaria contra bacterias y hongos extracelulares. Los linfocitos Th17 también participan en respuestas autoinmunitarias. Además de estos tipos de linfocitos T cooperadores, se han descrito linfocitos Th17/similares a Th1 (IL-17A/IFN-γ) que coexpresan ambas citocinas características. El paradigma Th1/Th17 proporciona un modelo útil para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares que median tanto la respuesta inmunitaria protectora como la perjudicial. El kit de fenotipado BD Human Th1/Th17 proporciona una combinación tricolor fácil de usar de anticuerpos fluorescentes —específicos para CD4, IFN-γ (para Th1) e IL-17A (para Th17)— que permitirá a los investigadores identificar y caracterizar la naturaleza de estos tipos de linfocitos T cooperadores mediante análisis de citometría de flujo multicolor. El kit puede utilizarse para analizar con éxito muestras de células linfoides ex vivo (p. ej., para los tipos de linfocitos T cooperadores de sangre periférica humanos generados in vivo) o para monitorizar la diferenciación de linfocitos T cooperadores en células cultivadas en diversos sistemas modelo experimentales. Los investigadores deben tener en cuenta que el color del inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ puede variar de transparente (incoloro) a amarillo claro.
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Almacenar sin diluir a 4 °C y protegido de la exposición prolongada a la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o ascitis por cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con FITC en condiciones óptimas y se eliminó el FITC no reaccionado. El anticuerpo se conjugó con R-PE en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PE libre. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda el almacenamiento de conjugados de PerCP-Cy5.5 en diluyentes no optimizados, ya que puede resultar en la pérdida de intensidad de la señal.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A. Estimulación de las células Se han descrito diversos métodos in vitro para la polarización o estimulación de subconjuntos de células T auxiliares, de los cuales PMA (éster de forbol) más ionomicina (ionóforo de calcio) ha sido particularmente útil para inducir y caracterizar rápidamente células policlonales productoras de citocinas. Para este kit, recomendamos la estimulación de PBMC normales a una concentración de 1-10 millones de células por ml en medio durante 5 horas con PMA/ionomicina (a 50 ng/ml y 1 μg/ml respectivamente) en presencia del inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (incluido en el kit o n.º de cat. 554724). Añada 4 μl de BD GolgiStop™ por cada 6 ml de cultivo celular y mezcle bien. Se recomienda no mantener BD GolgiStop™ en cultivo celular durante más de 12 horas. Nota: Se deben realizar estudios cinéticos para determinar el tiempo de incubación óptimo para cada sistema experimental. Dependiendo del donante, las frecuencias de células productoras de citocinas derivadas de la activación de PBMC pueden variar ampliamente para una citocina específica. En particular, el número de células productoras de IL-17 puede ser muy bajo o incluso insignificante en PBMC estimuladas con PMA/ionomicina. En estos casos, se deben considerar los cultivos de polarización Th17. Para obtener información específica sobre la polarización de las células Th17, consulte las referencias. B. Tinción de las células 1. Recolección de las células Recolecte células de cultivos estimuladores in vitro tratados con un inhibidor del transporte de proteínas. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y lave dos veces con tampón de tinción (FBS) (Cat# 554656). Cuente las células y transfiera aproximadamente 1 millón de células a cada tubo de ensayo de flujo (Cat# 352008) para tinción inmunofluorescente. Las células deben protegerse de la luz durante todo el procedimiento de tinción y el almacenamiento. 2. Fijación de las células a. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA y suspenda completamente las células con 1 ml de tampón BD Cytofix™ frío (incluido en el kit o n.º de cat. 554655) e incube durante 10-20 minutos a TA. Nota: La agregación celular puede evitarse agitando con vórtex antes de añadir el fijador. b. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA. Nota: Después de la fijación, el sedimento celular después de la centrifugación está suelto y se debe tener cuidado al aspirar el tampón de lavado de los tubos. No aspire TODO el tampón, pero deje 50-150 µl de solución en los tubos para evitar la pérdida de células en todos los pasos de lavado posteriores que se indican a continuación. c. Lave las células dos veces a TA en tampón de tinción (FBS) y centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a TA. Nota: Las células se pueden almacenar en tampón de tinción a 4 °C durante un máximo de 72 horas o en 90 % FCS/10 % DMSO a -80 °C durante un máximo de seis meses (para muestras que se deban almacenar durante más de seis meses, recomendamos realizar estudios de estabilidad). 3. Permeabilización de las células fijadas a. Para células mantenidas a 4 °C, centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente y retire el tampón de tinción. b. Para células almacenadas a -80 °C, descongélelas y lávelas dos veces con tampón de tinción (FBS) para eliminar el DMSO. c. Diluya tampón BD Perm/Wash™ 10x (incluido en el kit o n.º de cat. 554723) en agua destilada para preparar una solución 1x antes de usar. d. Suspenda las células en 1 ml de tampón BD Perm/Wash™ 1x e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. e. Centrifugue las células a 250 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente y elimine el sobrenadante. 4. Tinción con el cóctel: a. Suspenda completamente las células fijadas/permeabilizadas en cada tubo en 50 μl de tampón BD Perm/Wash™ y añada 20 μl/tubo de cóctel o un control negativo adecuado. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en oscuridad. Las células deben protegerse de la luz durante todo el procedimiento de tinción y el almacenamiento. b. Opcional: Tinción de antígenos de superficie celular adicionales. Nota: Si el instrumento lo permite, se puede realizar en este momento la tinción multicolor opcional de diferentes antígenos de superficie celular. Ejemplo: PE-Cy™7 CD3 (clon SK7, n.° de cat. 557851), V450 CD8 (clon RPA-T8, n.° de cat. 560347) y V450 CD45RA (clon HI100, n.° de cat. 560362), etc. Para la tinción de la superficie celular tras la fijación/permeabilización, es necesario identificar clones de anticuerpos adecuados que reconozcan epítopos desnaturalizados. Nota: Para los anticuerpos que no reconocen marcadores de superficie celular fijados/desnaturalizados, se recomienda realizar la tinción en células vivas ANTES de la fijación/permeabilización. c. Lavar las células dos veces con 1 ml de tampón BD Perm/Wash™ 1× a temperatura ambiente y suspender en tampón de tinción (FBS) antes del análisis por citometría de flujo. C. Análisis de citometría de flujo Ajuste el voltaje y la compensación de PMT utilizando células no teñidas y marcadores de superficie celular apropiados o utilice perlas de compensación BD™ (Cat. n.° 552843) según el protocolo recomendado. Nota: Se ha informado que la expresión de CD4 en células T disminuye después de la activación celular. Nota: Adquiera al menos de 20 000 a 30 000 linfocitos CD4 positivos. Dependiendo del donante, las frecuencias de células productoras de citocinas derivadas de la activación de PBMC humanas pueden variar ampliamente para una citocina en particular. Para realizar mediciones de frecuencia estadísticamente significativas, se deben adquirir tamaños de muestra suficientemente grandes durante el análisis de citometría de flujo. Se pueden generar gráficos de puntos bivariados o gráficos de contorno de probabilidad tras el reanálisis de datos para mostrar las frecuencias y los patrones mediante los cuales las células individuales coexpresan ciertos niveles de antígeno de superficie celular y proteínas citocinas intracelulares. Advertencias y precauciones Peligro: El inhibidor del transporte de proteínas BD GolgiStop™ (componente 51-2092KZ) contiene 99,61 % de etanol (p/p) y 0,26 % de monensina, sal monosódica (p/p). Indicaciones de peligro: Líquido y vapores muy inflamables. Provoca irritación ocular grave. Declaraciones de precaución: Mantener alejado del calor, chispas, llamas abiertas y superficies calientes. No fumar. Llevar guantes y gafas de protección. Llevar ropa de protección. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese inmediatamente la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua o dúchese. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Siga enjuagando. Deseche el contenido o el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. Peligro: El tampón de fijación BD Cytofix™ (componente 51-9006613) contiene 4,2 % (p/p) de formaldehído. Indicaciones de peligro: Nocivo por inhalación. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que causa defectos genéticos. Puede causar cáncer. Vía de exposición: Inhalatorio. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución: Llevar ropa y protección ocular. Llevar guantes de protección. No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o sarpullido en la piel: Consultar a un médico.
Avisos del producto: Avisos del producto Tenga en cuenta las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que se produce en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos tomar precauciones especiales (como envolver los viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con dichos reactivos, a la iluminación ambiental. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un solo láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, que pueden excitar directamente tanto a PerCP como a Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 pueden utilizarse con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. Este producto conjugado con PerCP se vende bajo la licencia de la patente estadounidense n.º 4.876.190. Cy es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Este producto conjugado se vende bajo la licencia de las patentes estadounidenses n.º 5.486.616; 5.569.587; 5.569.766; 5.627.027. Este producto está sujeto a los derechos de propiedad de Amersham Biosciences Corp. y la Universidad Carnegie Mellon, y se fabrica y vende bajo la licencia de Amersham Biosciences Corp. Este producto tiene licencia de venta exclusiva para investigación. No está autorizado para ningún otro uso. Si necesita una licencia comercial para usar este producto y no la tiene, devuelva este material sin abrir a BD Biosciences, 10975 Torreyana Rd, San Diego, CA 92121, y se le reembolsará el dinero pagado por el material. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las hojas de datos de seguridad (SDS).